189473. lajstromszámú szabadalom • Hatóanyagként B-41 D jelű vegyületet tartalmazó akaricid készítmény és eljárás a hatóanyag előállítására

1 „ 189 4 j

on Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry japán deponálóhelyen deponáltuk, ahol Ferm 1438 számon hozzáférhető (ismert Bikoken-kinki 1438 néven is). 5

A Streptomyces B-41-146-os számú törzs megfelelő táptalajban történő tenyésztésével állítjuk elő a B-41D jelű vegyületet, amelyet a fermentléből izolálunk. A Streptomyces genus mikroorganizmusok tenyésztéséhez el az általában használatos táp- 10 talajokat alkalmazhatjuk. Általában ismeretes, - hogy ezek a táptalajok legalább egy asszimilálható szénforrást és egy asszimilálható nitrogén forrást tartalmaznak. Szénforrásként megfelel a glükóz, a szacharóz, a keményítő, a glicerin, a malátae * 15

traktum, a melaszok és a szójababolaj. Különösen előnyösen alkalmazható szénforrásként a glükóz, előnyösen legfeljebb 8 tömeg/térfogat% mennyiségben, még előnyösebben 6-8 tömeg/térfogat% mennyiségben, a táptalajra vonatkoztatva. Továb- 20 bi szénforrásként a glükózon kívül előnyös egy vagy több laktóz, maltóz és kukoricakeményítő alkalmazása, előnyösen 0,5-2 tömeg/térfogat % mennyiségben. Konstans pH érték elérése céljából előnyös, ha a tenyésztés folyamán további glükózt 25 használunk.

Nitrogén forrásként előnyösen szójabablisztet, búzacsírát, hús-extraktumot, peptont, friss élesztőt, kukoricalekvárt, ammónium-szulfátot és ammónium-nitrátot használunk. Különösen előnyö- 30 sen alkalmazható nitrogénforrásként a szójababliszt és a fölözött tej kombinációja, amelyben a szójababliszt mennyisége előnyösen 0,5-1 tömeg/ térfogat% és a fölözött tej mennyisége előnyösen

1-2 tömeg/térfogat%. Kívánt esetben a táptalajhoz 35 aminosavat, pl. glicint vagy arginint adhatunk.

Kívánt esetben szervetlen sókat, pl. kalciumkarbonátot, nátrium-kloridot, kálium-kloridot vagy foszfátokat adhatunk a táptalajhoz, mint ahogy más szerves vagy szervetlen anyagok hozzá- 40 adása is előnyös lehet, amelyek a mikrobiális növekedést és a kívánt anyag termelését segítik elő.

Meglepően jó termelést érünk el a B-41D vegyület előállításánál, ha 6-8 tömeg/térfogat % glükózt, 0,5-2 tömeg/térfogat% laktózt és/vagy maltózt és/ 45 vagy kukoricakeményítőt, 0,5-1 tömeg/térfogati szójabablisztet és 1-2 tömeg/térfogat% fölözött tejet tartalmazó táptalajt használunk.

Bár valamennyi Streptomyces B-41-146 törzset tenyésztő eljárást alkalmazhatjuk a biológiai aktív 50 anyagok előállítására, előnyös, ha folyékony táptalajt, különösen szubmerziós táptalajt használunk.

A tenyésztést előnyösen aerob körülmények között végezzük, a hőmérsékletintervallum tág határokon belül, azaz 22-30 °C között változhat, előnyösen 28 55 °C körül van. A kívánt B-41D vegyület előállítása

5-10 tenyésztési nap után fejeződik be teljesen rázás közben vagy tankban.

A B-41D vegyület meghatározását a táptalajban az alábbi módon végezhetjük : go

Ismert mennyiségű táptalajt, pl. 3 g-ot, egy kis kémcsőbe vezetünk, amelyhez 10 ml acetont adunk és az elegyet rázással extraháljuk, majd centrifugáljuk. Az így kapott szupematáns oldathoz ezután acetont adagolunk, amíg az össztérfogat a 10 ml-t g5

3 2

el nem éri. A kapott oldatot ezután előre meghatározott helyzetben vékonyrétegű kromatográfiás lemezre visszük fel (szilikagél, pl. Kieselgel öO F254, Merck) pl. 10-20 pl mennyiségben. A lemezt ezután

4 óráig hívjuk elő dioxán és széntetraklorid 18 : 82 térfogatarányú elegyével. A mintát ezután kettős hullámhosszú vékonyrétegkromatográfiás letapogatóval mérjük 245 mp-nál és vakpróbát készítünk, amelyet 380 mp-nál mérünk. A minta abszorpcióképességét összehasonlítjuk egy standard minta abszorpcióképességével és az abszorpcióképességből kiszámítjuk a B-41D vegyület mennyiségét.

A B-41D vegyületet a táptalajból természetes adszorbens, pl. aktív szén, alumínium-oxid vagy szilikagél, szintétikus adszorbens, pl. Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemical Industries Limited terméke), abszorbens, pl. Avicel, (Asahi Chemical Industry Co., Limited terméke) vagy szűrőpapír, ioncserélő gyanta, ioncserélő gélszűrő stb. segítségével nyerjük ki. A termék izolálását azonban leghatásosabban az alábbi módszerrel végezhetjük.

Először a fermentlevet segédanyag, pl. diatomaföld segítségével leszűrjük, és így egy kalácsot kapunk, amelyet metanollal extrahálunk, így a kívánt anyagot vizes-metanolos oldatban oldjuk fel. Ezután a vizes-metanolos oldathoz vizet adunk és a kapott oldatot hexánnal extraháljuk. A hexános fázist elválasztjuk és csökkentett nyomáson bepárolva besűrítjük, így a kívánt B-41D vegyületet tartalmazó olajos anyagot kapjuk. Az olajos anyagot szilikagélt, pl. Wakogel C-200-at tartalmazó oszlopra helyezzük és megfelelő eleggyel, pl. hexán és aceton 90 : 5 térfogatarányú elegyével eluálva a kívánt vegyületet tartalmazó frakciókat kapunk. A frakciókat csökkentett nyomáson bepároljuk, és az így kapott olajos anyagot kis mennyiségű metanolban feloldjuk és Sephadex LH-20 (Pharmacia Co.) oszlopra visszük és metanollal eluáljuk. A kívánt terméket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, az oldószert eltávolítjuk és a maradékot kis ménynyiségű metanolban feloldjuk. Ezután vizet adunk hozzá és az elegyet szobahőmérsékleten állni hagyjuk. A B-41D vegyületet hab vagy buborékokat tartalmazó anyag formájában kapjuk, amelyeket azután amorf porrá alakítunk. Az elegyet hexán és etil-acetát 20 : 1 térfogatarányú elegyéből átkristályosítjuk és így a B-41D vegyületet apró tűk formájában kapjuk. Olvadáspont 186-188 °C.

Bár a B-41D vegyületet a fenti módon izolálhatjuk és tisztíthatjuk, a fenti tisztítási folyamatot megszakíthatjuk bármelyik fázisban és így olyan nyers terméket használhatunk fel a továbbiakban, amely a B-41D vegyület és milbemicinek elegyet tartalmazza. Ha kettő vagy több ilyen vegyület elegyét használjuk fel szétválasztás nélkül, akkor elég oly mértékben tisztítani az elegyet, hogy 5 ppm koncentrációnál 100%-os akaricid hatást kapjunk. Ilyen esetben a B-41D vegyület tartalom a nyers elegyben előnyösen legalább 25 tömeg %, előnyösebben 50 tömeg% körüli, és a maradék a fermentléből és más milbemicinekből álló szennyeződés.

A találmány szerint előállított vegyület kiemelkedő akaricid hatást mutat Tetranychus urticae, gyümölcsfa takácsatka (Panonychus ulmi) és citromfa takácsatka (Panonychus citri) és szőlő levélatka (pl.

3