189469. lajstromszámú szabadalom • Eljárás daganatellenes, ellenanyag-hatású ricin-A alegységet tartalmazó immunoglobulin-származékok előállítására
t 189 469 2 mp-nál megmértük az egyes frakciók abszorbanciáját. A mérések eredményeit a 4. ábrán mutatjuk be. Az ábrán három csùçs látható, melyeket balról jobbra rendre I, II és III számokkal jelöltünk. A fehérjék azonosítását SDS’ PAGE segítségével végeztük el. A II csúcs a Fab’ fragmentumot (vö. 7 lemez), a III csúcs pedig A alegységet (vö. 8 lemez) jelenti. Az I csúcs egy, az A alegység dimerjéhez, azaz F(ab’)2-höz közel álló sávot mutat (vö. 6 lemez). Ha azonban akár az I csúcsnak megfelelő anyagot és az A alegység dimerjét összekeverjük és elektroforézisnek vetjük alá, a három fajta fehérje világosan megkülönböztethető egymástól (vö. 9 és 10 lemez). Továbbá, ha az I csúcsnak megfelelő anyagot 2-merkapto-etanollal kíméletesen redukáljuk, akkor az Fab’-re és A alegységre válik szét (vö. 11 lemez). A fentiek megerősítik azt, hogy az I csúcs megfelel egy olyan hibridnek, amely diszulfid híddal 1:1 arányban összekapcsolódott Fab’ fragmenst és A alegységet tartalmaz. (e) A daganatellenes fehérje-hibrid citotoxicitása Abból a célból, hogy találmány szerinti fehérjehibridet tartalmazó sóoldatot (1,1 mg/ml) kapjunk, összegyűjtöttük a 4. ábra bevonalkázott részébe eső frakciókat. Ezt a vizes oldatot a találmány szerinti fehérje-hibrid citotoxicitásának meghatározása céljából L 1210 leukémiás egér sejteken vizsgáltuk. 2,0 cm2-es alapterületű tenyészedényben összekevertünk 1,4 ml RPMI 1640 közeget (amely 10% főtális borjú szérumot és 20 mikrontól 2-merkaptoetanolt tartalmaz), 0,1 ml L 1210 sejt szuszpenziót (5 x 105 sejt/ml) és 0,1 ml vizsgálati mintát (ricin vagy találmány szerinti fehérje-hibrid). Ezenkívül adott esetben hozzáadtunk még nyúl-Fab’-ellenanyagot (130 mikrogramm/milliliter) (mely ellenanyagot kecskének nyúl Fab’-vel való immunizálásával kaptunk) vagy 0,1 mól (végső koncentráció) alfa-laktózt, mint inhibitort. A tenyésztést 5% széndioxidos atmoszférában 42 órán át folytattuk 37 °C-on. Ezután a citotoxicitást fázis-kontraszt mikroszkópon figyeltük meg. Abban az esetben, ha a globuláris sejtek mindegyike károsodott, az eredmény + + + jellel jelöltük; ha 90-50%-uk károsodott, azt + + jellel jelöltük ; ha 50-10%-uk károsodott, azt + jellel jelöltük, és ha az eredmények megegyeztek a kontroliéval, azt - jellel jelöltük. Az eredmények az 1. táblázatban láthatók. I. táblázat A daganatellenes fehérje-hibrid citotoxicitása L 1210 sejtekkel szemben Inhibitor Ricin (ng/ ml) 70 Találmány szerinti fehérje-hibrid (ng/ml) 7 0,7 7000 700 70 Semmi + + + + + + + + + -Nyúl-Fab’-ellenanyag + + + + + + -Alfa-laktóz + +- + + + Nyúl-Fab’-ellenanyag + alfa-laktóz + +Az 1. táblázatból megállapítható, hogy a ricin erős, nem szelektív toxicitással rendelkezik, és ezt a toxicitást a nyúl-Fab’-ellenanyag nem befolyásolja, de az alfa-laktóz - amely egy, a sejtek és a ricin összekapcsolódását inhibitáló anyag - csökkenti. Másrészt jóllehet a találmány szerinti fehérjehibrid toxicitása gyengébb a ricinénél, de még így 5 is elegendő mértékű citotoxicitással rendelkezik. Abból, hogy a nyúl-Fab’-ellenanyag ezt a toxicitást teljesen el tudja nyomni, az következik, hogy a fehérje-hibrid Fab’ fragmensét tartalmazó oldallánc igen fontos szerepet játszik ebben a citotoxici- 10 tásban. Arra is fény derült, hogy mivel ez a toxicitás - a ricintől eltérően - nem érzékeny az alfa-laktóz hatására, a toxicitás nem származhat valamilyen ricin-szennyeződéstől, és hogy a mutatott toxicitás mechanizmusa eltér a ricinétől. Ezekből a tények- 15 bői az következik, hogy a találmány szerinti fehérje-hibrid várhatóan specifikus toxicitással rendelkezik olyan daganatsejtekkel szemben, amelyeket a Fab’ fragmens képes felismerni. (a) 4-Piridil-tio-csoportot tartalmazó Fab’ fragmens előállítása 25 2,0 ml fehérje oldathoz - miután a F(ab’)2 redukcióját az 1. példa (a) pontja szerint végrehajtottuk - hozzáadtunk 0,2 ml, 50 mM 4,4’-dipiridil-diszulfidot tartalmazó etanolt, és a reakciót 30 percig hagytuk folyni szobahőmérsékleten. Ezt a reak- 30 cióselegyet Sephadex G25 oszlopon kromatografáltuk a kis molekulasúlyú anyagok eltávolítása, illetve a 4-piridil-tio-csoportot tartalmazó Fab’ fragmens kinyerése végett. (b) Daganatellenes fehérje-hibrid előállítása 35 1,57 ml, 6,6-os pH-jú [0,1 mólos foszfát-puffer -2 mmólos etilén-diamin-tetraecetsav] oldatban öszszekevertünk 12,5 mg, aktív diszulfidcsoportot tartalmazó és az iménti (a) pontban előállított Fab’ fragmenst és 6,1 mg, 1. példa (c) pontjában előállí- 40 tott ricin A alegységet abból a célból, hogy az összekapcsolódási reakciót szobahőmérsékleten 3 óra alatt végrehajtsuk. Ezután megismételtük az 1. példa szerinti eljárást, hogy megkapjuk a találmány tárgyát képező fehérje-hibridet, amely egy diszulfid 45 híddal összekötött A alegységet és Fab’ fragmenst tartalmaz. 3. példa 50 3,6 ml, 9,15-os pH-jú [0,1 mólos glicin-puffer - 2 mmólos etilén-diamin-tetraecetsav] oldatban öszszekevertük 13,1 mg, 1. példa (a) pontja szerint előállított és tiolcsoportot tartalmazó Fab’ frag- 55 menst és 5,8 mg, 1. példa (c) pontja szerint előállított ricin A alegységet abból a célból, hogy az összekapcsolódási reakciót szobahőmérsékleten 8 óra alatt lefolytassuk. Ezután megismételtük az 1. példa szerinti eljárást, hogy megkapjuk a találmány gg szerinti fehérje-hibridet, amely egy diszulfid híddal összekötött A alegységet és Fab’ fragmenst tartalmaz. 65 7
