189469. lajstromszámú szabadalom • Eljárás daganatellenes, ellenanyag-hatású ricin-A alegységet tartalmazó immunoglobulin-származékok előállítására
1 189 469 2 4. példa (a) S-szulfo-csoportot tartalmazó Fab’ fragmens előállítása 2,0 ml, 18,3 mg 1. példa (a) pontja szerint előállított F(ab’)2 fragmenst tartalmazó [0,1 mól trisz HC1 - 2 mmól etilén-diamin-tetraecetsav]-hoz (pH = 7,8) hozzáadtunk 1,7 mg nátrium-szulfitot és 0,7 mg nátrium-tetrationátot abból a célból, hogy 1 óra alatt 37 °C-on végrehajtsuk a szulfonálási reakciót. A szulfonált oldatot az 1. példa (a) pontjában ismertetettek szerint Sephadex G25 oszlopon kromatografáltuk, így S-szulfo-csoportot tartalmazó Fab’ fragmenst nyertünk ki. (b) Daganatellenes fehérje-hibrid előállítása 130 mg, S-szulfo-csoportot tartalmazó és az iménti (a) pontban előállított Fab’ fragmenst és 5,6 mg, 1. példa (c) pontjában előállított ricin A alegységet összekevertünk 1,82 ml [5 mmól acetát-puffer -0,14 mól nátrium-klorid - 1 mmól etilén-diamintetraecetsav] (pH = 5,5) oldattal. A keveréket a reakció végrehajtása céljából 3 napon át dializáltuk 4 °C-on 1 liter [0,1 mól glicin-puffer - 2 mmól etilén-diamin-tetraecetsav] (pH = 9,15) oldat ellenében. Ezután megismételtük az 1. példa szerinti eljárást, hogy megkapjuk a találmány tárgyát képező, diszulfid híddal egymáshoz kapcsolt A alegységet és Fab’ fragmenst tartalmazó fehérje-hibridet. 5. példa Elkészítettünk egy Fab’ fragmens oldatot (7 mg/ ml) úgy, hogy az 1. példa (a) pontjában előállított, egy tiolcsoportot tartalmazó anti-L 1210 immunoglobulin IgG Fab* fragmensét feloldottuk egy 2 térfogatrész 0,1 mólos nátrium-foszfát-puffert (pH = 6,0) és 1 térfogatrész acetont tartalmazó keverékben. Ettől elkülönítve elkészítettünk egy térhálósítószert tartalmazó szuszpenziót, amely N,N’(l,4-fenilén)-dimaleinsavimid (PDM) acetonos oldatából (5 mg/ml) állt. 0,1 ml PDM oldatot cseppenként hozzáadagoltunk 1,0 ml Fab’ fragmens oldathoz, és a reakciót 30 percen át hagytuk folyni szobahőmérsékleten. A kapott reakcióelegyből lepárlással eltávolítottuk az acetont, majd az oldhatatlan anyagokat 10 000 for./perc-en 30 percig folytatott centrifugálással távolítottuk el. Az így kapott oldatot 0,1 mólos nátrium-foszfát-pufferrel (pH = 7,0) kezelt Sephadex G25 oszlopon kromatografáltuk, így egy PDM csoportot tartalmazó Fab’ fragmens oldatot kapunk. A PDM csoportot tartalmazó Fab’ fragmens így kapott oldatát összekevertük az 1. példa (c) pontja szerint előállított, egy tiolcsoportot tartalmazó ricin A alegységgel, és a keveréket úgy állítottuk össze, hogy a Fab’ fragmensnek az A alegységhez viszonyított mólaránya 1 : 0,7 legyen. Ezt követően a kapcsolódási reakciót 4 °C-on 24 órán át, majd 37 °C-on 1 órán át hagytuk folyni. A kapott reakcióelegyet az 1. példában megadottakkal azonos feltételek mellett Sephadex G150 oszlopon kroma 6 tografáltuk. A frakciók abszorbanciájának 280 mp-nál történő mérésének eredményei szerint az 1. példához hasonlóan három csúcsot figyeltünk meg. Az I csúcs alatt lejött 37. és 38. frakciók adták a 5 kicsapódási reakciót kecske anti-nyúl IgG antiszérummal és tengerimalac anti-ricin A antiszérúmmal is. Nátrium-dodecil-szulfáttal végrehajtott elektroforézissel arról is meggyőződtünk, hogy molekulasúlyuk 76 000, valamint, hogy 2-merkapto-etanol- 10 lal kezelve nem választhatók szét Fab’ fragmensre és A alegységre. Ezekből a tényekből bizonyossá vált, hogy a 37. és 38. frakciók a találmány tárgyát képező fehérje-hibridet tartalmazták, pontosabban hogy ezek a frakciók olyan fehérje-hibridet tartal- 5 maztak, amelyben a PDM (egy térhálósítószer) a megfelelő kénatomokon keresztül összeköti a Fab’ fragmenst és az A alegységet. Úgy találtuk, hogy ez a fehérje-hibrid L 1210-zel szembeni citoxicitását tekintve pont olyan hatékony, mint az 1. példa 20 szerinti fehérje-hibrid. Hozam értékek az 1-5. példánál: 1:38%, 2: 35%, 3: 1%, 4: 35%, 5: 31%. Szabadalmi igénypontok Eljárás az (I) általános képletü daganatellenes, ellenanyaghatásű ricin A alegységet tartalmazó immunoglobulin-származékok előállítására, ahol az 30 (I) általános képletben a Fab anti-L-1210 immunoglobulin fragmenst jelent; az RA a ricin A alegységét jelenti ; X jelentése a (4), (5), (6), (7), (8) és (9) képletü csoport - ahol k jelentése 2—15-ig terjedő egész szám -, S, és S2 egyaránt kénatomot jelent, 35 melyek közül Sx egy immunoglobulinban lévő diszulfid kötésből (—S—S—) származó kénatomot, míg S2 a ricinben lévő diszulfid kötésből származó kénatomot jelent; n értéke 0 vagy 1 ; azzal jellemezve, hogy 40 a) olyan (I) általános képletü vegyületek előállítása esetén, amelyek képletében n értéke 0, egy daganatellenes immunoglobulin legalább egy S- szulfo-csoportot (—S—S03—) vagy (V) általános képletü aktív diszulfid-hidat tartalmazó - az (V) 45 általános képletben Z jelentése (1), (2) vagy (3) képletü csoport - Fab-fragmentumot ricin legalább egy tiolcsoportot tartalmazó A alegységével reagáltatjuk, b) olyan (I) általános képletü vegyületek előállí- 50 tásakor, amelyek képletében n értéke 1, egy daganatellenes immunoglobulin legalább egy tiolcsoportot tartalmazó Fab-fragmentumát egy legalább két funkciós csoportot tartalmazó térhálósítószer, előnyösen egy (III) általános képletü vegyület - 55 ahol a képletben Y jelentése fenilén-, —CH2—O—CH2— vagy (10) képletü csoport - vagy egy IV általános képletü vegyület - ahol a képletben Z jelentése —NH—(CH2)k—NH- csoport, ahol k jelentése a fenti és X, és X2 halogén- 60 atomot jelent - jelenlétében ricin legalább egy tiolcsoportot tartalmazó A alegységével reagáltatjuk. 6 oldal rajz 8
