189441. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a Streptomyces és a Nocaradia nemzetséghez tartozó mikroorganizmusok nemzetségen belüli vagy egymásközötti genetikai információ cseréjére, protoplasztok fúzióvjával
1 .189 441 2 Táptalajként előnyösen folyékony halmazállapotú táptalajt használunk, például Nutrient táptalajt, vagy Trypticase-szójából készült táptalajt. Ezen táptalajok összetétele a következő: Nutrient táptalaj: Húskivonat 3 g Pepton 5 g. 1000 ml desztillált vízben oldva, majd 15 percen át 10s Pa nyomáson sterilizálunk; a pH stabilizálás után 6,8. (Lásd: Standard Methods for the Examination of Water and Sewage, 9th kiadás 185. old. /1946/). Gyártja: Difco Laboratories - Detroit, Michigan. Trypticase-szója táptalaj: (Soybean-Casein Digest Medium) Pankreázos kazein-hidrolizátum 17,0 g szója pepton 3,0 g nátrium-klorid 5,0 g dikálium-foszfát 2,5 g dextrin 2,5 g víz 1,0 1-re, pH = 7,3. Gyártja: BBL Division of Becton Dickinson and Company, Cockeysville, Maryland 21 030. A glicin jelenlétében végzett növesztés után a sejteket protoplaszttá alakítjuk. Ezt általában úgy végezzük, hogy mossuk a micéliumokat, majd hipertóniás oldatban szuszpendáljuk őket. Az előnyös hipertóniás oldat például szaharózt, magnézium-ionokat, kalcium-ionokat és foszfát-ionokat tartalmaz. Az Okanishi és munkatársai (lásd fent) által megadott P jelű táptalaj ilyen előnyös hipertóniás oldat. A sejtszuszpenzióhoz 1-2 mg/ml lizozimot adunk, majd 30 °C és 37 ”C közötti hőmérsékleten addig inkubáljuk a tenyészetet, míg a protoplasztok képződése teljessé válik (0,5-2,0 óra), A protoplasztok képződésének teljessé válását fáziskontraszt mikroszkóppal ellenőrizzük. A protoplasztok fúzióját a találmány értelmében úgy érjük el, hogy a két szülőorganizmusból előállított protoplasztokat a fúzió indukálására összekeverjük. A szülőtörzsek tartozhatnak azonos fajhoz (intraspecies), de tartozhatnak különböző fajhoz is (interspecies). Centrifugáljuk a protoplasztok keverékét, a protoplasztokból álló üledéket kismennyiségü hipertóniás pufferban szuszpendáljuk. A fúziót úgy érjük el, hogy a protoplasztokat polietilénglikollal kezeljük. Például úgy járunk el, hogy hipertóniás pufferral készült polietilén-glikol oldatot (előnyösen 40%-os oldatot) adunk a szuszpendált protoplasztokhoz. Az így kapott fuzionált protoplasztokat hipertóniás agarra szélesztjűk (például az Okanishi és munkatársa (lásd fent) által ismertetett R2 táptalajra, vagy ennek módosított változataira). A fuzionált protoplasztokból a találmány szerinti eljárás értelmében úgy regeneráljuk a sejteket, hogy a fuzionált protoplasztokat hipertóniás agáron előnyös hőmérsékleten inkubáljuk. Az előnyös inkubációs hőmérséklet meghatározható abból az optimális hőmérsékletértékből, ahol a szülőtörzsek növekszenek. A genetikai információkészlet kicserélődésének bizonyításához előnyösen olyan fajokat használunk, amelyek megfelelő genetikai markereket (jeleket) hordoznak, mint például az auxotrofiát vagy antibiotikum-rezisztenciát. A kísérletek ezen fázisában előnyös, különösen a fajok közötti genetikai keresztezéskor, ha meghatározzuk a sejtek azon élettani növekedési körülményeit, amelyek előnyösek a protoplasztok regenerálódása számára. A protoplasztok regenerálódásának aránya a sejteknek a protoplaszt-fúzió előtti élettani állapotától függően kisebb mint 10'5 és 5 x 10'1 között változik. Baltz „Eljárás hatékony sejtregenerációra képes Streptomyces protoplasztok előállítására” című szabadalmi leírásban (Docket No. X-4479) megadja a nagyarányú regenerálódásra képes Streptomyces protoplasztok előállításának módszerét. Az eljárás során meghatározza a protoplasztok átalakításának optimális állapotát. Az optimális állapot az exponenciális és a stacioner növekedési fázis közötti átmeneti szakaszban van. A legelőnyösebb állapotot a Streptomyces növekedési ciklusának vizsgálatával határozhatjuk meg. Ezt előnyösen turbidometriás méréssel végezzük, az optikai sűrűséget (OD) 600 nm hullámhosszúságon határozzuk meg (A 600). A Streptomyces fajokra általában a gyors exponenciális növekedés jellemző, a sejtkétszereződési idő kis sejtsűrűség esetén (A600< 1,5) oldódó komplex táptalajon 1,5 óra és több óra között változik. Ahogy a sejtnövekedés mértéke eléri az A 600 1,5-4,0 közötti értéket, a sejtek a stacioner növekedési fázist megelőzően az átmeneti fázisba lépnek. Az átmeneti fázis 2 óra és 24 óra közötti ideig tart, ezalatt a sejttömeg 50%-tól hatszorosára nőhet a kérdéses fajtól függően. A ‘eltételezett hibrid törzseket, köztük a rekombinánsokat ezután klónozzuk, és ismert módszereket használva genetikailag vizsgáljuk annak megállapítására, hogy tartalmaznak-e olyan géneket, amelyek mindkét szülőből származnak. A valódi hibrid törzseket, köztük a rekombinánsokat ezután az adott előnyös tulajdonság jelenléte szempontjából vizsgáljuk. A találmány szerinti eljárás alkalmazható a Streptomyces és Nocardia nemen belüli mikroorganizmusok genetikai információanyagának cseréjére is, amely az élettani összeférhetetlenség miatt általában nem következik be. A találmány szerinti eljárással ez az információcsere és a dezoxi-ribonukleinsav rekombinációja igen nagy gyakorisággal következik be. A találmány szerinti eljárást különösen előnyösen használhatjuk az azonos fajba tartozó mutáns mikroorganizmusok közötti genetikai cseréhez. A találmány szerinti eljárás különösen értékes az antibiotikumot termelő Streptomyces törzsek termelésének fokozásakor. A találmány szerinti eljárással például a Streptomyces fradiae törzsekkel milliliterenként 104 és 105 közötti számú rekombinánst kapunk, más szóval élő protoplasztokra számolva a rekombinánsok gyakorisága 10'4 és 10”3 közé esik. Laboratóriumunkban azok a kísérletek, amelyeket a Streptomyces fradiae törzseinek genetikai rekombinánsai előállítására ismert módszerekkel (Hopwood, Bact. Rév., 31, 373-403, 1967) végeztünk, sikertelenek voltak: rekombináns telepeket nem tudtunk izolálni (azaz számuk nem érte el az egyet 101 sejt kö5 10 15 20 25 30 40 45 50 55 60 65 3
