189441. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a Streptomyces és a Nocaradia nemzetséghez tartozó mikroorganizmusok nemzetségen belüli vagy egymásközötti genetikai információ cseréjére, protoplasztok fúzióvjával
1 .189 441 2 A találmány tárgya új eljárás a Streptomyces nemzetséghez tartozó mikroorganizmusok nemzetségen belüli vagy egymás közötti protoplaszt fúzióval kivitelezett genetikai információcserére. A genetikai információcsere a spontán bekövetkező mutációval együtt jelenti azt a természetes módszert, amellyel a mikroorganizmusok megtartják azt a változékonyságot, amire szükségük van a különleges körülményekhez való alkalmazkodáshoz. A természetben bekövetkezik a genetikai információcsere, legalábbis az azonos fajhoz tartozó mikroorganizmusok között. A laboratóriumokban régóta ismert módszereket alkalmaznak a mikroorganizmusok közötti genetikai információcsere létrehozásakor, ilyen a konjugáció, a DNS (dezoxiribonukleinsav) transzformáció és a fágok által vezérelt transzdukció. Az információcsere létrejöhet kromoszomális vagy kromoszómán kívüli genetikai anyag cseréjével. A genetikai információcserét követően genetikai rekombinációval vagy plazmid átvitellel hibrid-törzsek jöhetnek létre, heterokarion és merodiploid törzseket kaphatunk. Az olyan mikroorganizmusok genetikai készletének hatásos cseréjére, amelyek nem rendelkeznek hatékonyan működő természetes, a kicserélődést irányító rendszerrel, nehéz laboratóriumi körülményeket teremteni, ez igen időigényes és egyes esetekben eredménytelenül végződő munkát jelent. A nehézségek a DNS sejtbe jutásával kapcsolatosak, fizikaiak vagy a DNS szállítását irányító enzimrendszerrel kapcsolatosak, mint például a sejtfalak és a nukleázok. A fágok által irányított transzdukciókor a transzdukciós rendszerek kialakításakor az adott mikroorganizmusra jellemző transzdukáló tulajdonságú vírusok izolálása és meghatározása okoz problémát. Az általánosan használható alapgondolatok és általános módszer hiánya szükségessé tette olyan hatásos módszerek kidolgozását, amely több mikroorganizmus genetikai készletének kicserélését teszi lehetővé. Ezenfelül a genetikai információcsere lehetősége igen jelentős lehetőséget tár fel a fajokon belüli változékonyság fokozására, amellyel gazdasági és terápiás szempontból fontos metabolitok, például antibiotikumok termelése válhat lehetővé. Ezen lehetőségek ipari alkalmazása között felmerülhet nagymennyiségű különleges metabolitok, például antibiotikumokat, rákellenes vegyületeket, enzimeket és más, használható tulajdonságokkal rendelkező mikrobiális termékeket termelő törzsek előállítása, továbbá olyan hibrid fajok létrehozása, amelyek új, értékes tulajdonságokkal rendelkező metabolitokat szintetizálnak. Napjainkban kifejlesztett módszer a genetikai készlet hatékony cserélésére a sejtfúzió, amelyet egyes eukariota szervezetek genetikai tanulmányozására sikeresen használtak. A sejtfúzióval végzett genetikai információ átadás prokariota (egymagú) mikroorganizmusok esetén ismeretlen volt Schaeffer és munkatársai, továbbá Fodor és Alföldi munkájáig (Schaeffer és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sei., 73, 2151-2155, 1976; és Fodor és Alföldi, Proc. Natl. Acad. Sei., 73, 2147-2150, 1976), akik a Bacillus nemhez tartozó mikroorganizmusok sejtjeiből készült protoplasztok fúziójának és regenerálásának módszerét dolgozták ki. Úgy találtuk, hogy a Streptomyces nembe sorolt prokariota sejtekkel végrehajthatjuk a genetikai információcserét protoplaszt-fúzióval. Ez a felfedezés lehetővé teszi, hogy egy általánosan használható és így rendkívül fontos módszert dolgozzunk ki a gazdasági szempontból fontos Streptomyces nemzetségbe sorolt hasonló és egymástól különböző fajok genetikai információcseréjéhez. Úgy találtuk továbbá, hogy a protoplaszt-fúzióval indukált genetikai információcsere elvégezhető a Streptomyces nemzetséghez és a vele szoros rokon Nocardia nemhez sorolt mikroorganizmusok között is. Úgy találtuk, hogy a Streptomyces nemzetségbe tartozó mikroorganizmusok. között protoplasztfúzióval genetikai információcserét hajthatunk végre. A találmány szerinti eljárás értelmében a genetikai anyag kicserélésére több lépésből álló módszer szerint úgy járunk el, hogy a. protoplasztokat készítünk, és stabilizáljuk azokat; b. protoplaszt-fúzióval genetikai információcserét hajtunk végre; majd c. a fuzionált protoplasztokból ismét sejteket regenerálunk. A regenerált hibrid törzseket, köztük a rekombinánsokat ezután különleges tulajdonságaik alapján vizsgáljuk. Ilyen különleges tulajdonságok lehetnek például egy ismert anyagcseretermék, mint például egy antibiotikum vagy rákellenes vegyület termelése, amely termelés az új törzsben fokozott mértékű, vagy olyan törzsben következik be, amelyből könnyebben különithető el. Kaphatunk olyan hibrid fajokat, amelyek új és használható anyagcseretermékeket termelnek, vagy egy ismert anyagcsereterméket nagyobb mennyiségben szintetizálnak. A találmány további tárgya eljárás a Streptomyces nemzetségbe és a Nocardia nemzetségbe tartozó mikroorganizmusok közötti genetikai információcsere megvalósítására, amit a protoplaszt-fúziós módszerrel végzünk. Az új eljárás több lépésből áll, nevezetesen a. a protoplasztok képzése és stabilizációjuk; b. a genetikai információt hordozó molekulák protoplaszt-fúzióval való kicserélése; végül c. a fuzionált protoplasztokból sejtek regenerálása. A protoplasztok képzését és stabilizációját a találmány szerinti eljárás értelmében úgy végezzük, hogy a. olyan körülmények között tenyésztjük a sejteket, ahol lizozim enzimre érzékenyek lesznek ; majd b. a sejtfal eltávolítása és protoplasztok képzésére hipertóniás pufferral készült elegyben lizozimmal kezeljük a sejteket. A sejtfal eltávolítását a találmány szerinti eljárás egy előnyös kivitelezési változata szerint úgy végezzük, hogy több generáción át olyan táptalajban növesztjük a sejteket, amely a növekedést már gátló koncentrációnál kisebb mennyiségű glicint tartalmaz. A glicin jelenlétében növekvő Streptomyces sejtek fala a lizozim enzimre érzékennyé válik (Okanishi és munkatársai, J. Gen. Microbiol., 80, 389-400, 1974). Bár a glicint nem tartalmazó táptalajon növekvő sejtek sok esetben protoplaszttá alakíthatók, ezek a protoplasztok azonban lassan és kis hatékonysággal jönnek létre. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
