189268. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán inzulin szemiszintetikus előállítására
1 189 268 2 körülmények, míg a poláris vagy ionizáló körülmények mellett végzett tisztításnak például a töltéssel bíró aminosavak kötése kedvez. A humán inzulin előállítására a maradék R1 csoportokat enzimes eljárással el kell távolítani az (I) általános képletű vegyületről. Az R1 csoport karboxipeptidázzal távolítható el. A karboxipeptidáz olyan exopeptidáz, amely a peptid karboxi-terminálisáról kiindulva egyenként, egymás után távolítja el az aminosavakat, egyes aminosavakkal szemben hatékonyabb. A karboxipeptidáz A (CPA) a hidrofób aminosavakat hasítja le, különösen előnyösen az aromás aminosavakat, például a fenilalanint, tirozint és triptofánt. Másrészt viszont a karboxipeptidáz B (CPB) a bázikus aminosavakat hasítja le könynyen. Ha az R1 csoport megfelelően megválasztott aminosavak kombinációja, a CPA és/vagy CPB a találmány szerinti eljárás megvalósítására igen alkalmas proteolitikus enzimek, de más karboxipeptidázok vagy dipeptil-karboxipeptidázok is alkalmazhatóak helyettük. A találmányt a továbbiakban példákkal világítjuk meg. A következő példákban minden esetben a dez(B 30) inzulin szerepel alapul, melyet sertés inzulinból E. W. Schmitt és munkatársai módszerével [lásd: Hoppe Seyler’s Z. Physiol. Chemie 359, 799 (1978)] állítottunk elő, ez az úgynevezett dez(A- la) inzulin (DAI). 1-6. Példa Di- és tripeptidek kötése DAI-hoz A kötés különféle szubsztrátok - di- és tripeptidek és tripeptidek hidrogén-klorid sói - és különféle enzimrendszerek - tripszin és hordozóhoz kötött tripszin és liziléndopeptidáz-jelenlétében történik. A kötéseket a következőképpen végezzük : v) Puffert készítünk- dimetil-formamid és etanol 1 : 1 arányú elegyéből (ez az úgynevezett szerves frakció) és 5 - 0,5 mól/1 tris-HCl puffer bizonyos mennyiségéből b) Mért mennyiségű szubsztrátot és DAI-t oldunk fenti puflferben. c) A kapott elegy pH-ját tömény, 1 mól/l-es nát- 10 rium-hidroxiddal a kívánt értékre emeljük. d) Hozzáadjuk a kötést létrehozó enzimet, a kötési reakciót 37 °C-on hajtjuk végre. ej A reakció befejeződése után a reakcióterméket kromatográfiás eljárással elválasztjuk, a kötési 15 reakció termékének hozamát a kromatogramból meghatározzuk és az elméleti érték százalékában kifejezve adjuk meg. Az 1-6. példákra vonatkozó reakciókörülményeket és a hozamokat az 1. táblázatban ismertetjük. 20 7. Példa A kötési reakció termékének elválasztása kromatográfiás eljárással 25 összehasonlítottuk a pepiiddel kötött DAI és az észterrel kötött DAI kromatográfiás viselkedését. Erre a célra az 1-4. példákban ismertetett módon elvégeztük DAI és thr-O-metil, thr-O-terc-butil, 3° thr-phe-O-metil, valamint DAI és thr-phe-phe-csoportok kötését. A reakció körülményei: 14g/1 DAI, 0,06mól/1 szubsztrát, 2,5 g/1 tripszin és 67% szerves frakció pH 6,4-es közegben, a reakcióidő fél óra. 35 A kötési reakció termékeit analitikai nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással elválasztjuk és a retenciós idő értékeket (Rf) meghatározzuk. Az elválasztási művelet eredményeit a 2. táblá-40 1. Táblázat Példa száma Körülmények 1. 2. 3. 4. 5. 6. DAI koncentráció (g/1) 67,1 66,6 13,6 25,2 32,2 32,2 Szubsztrát Koncentráció (mól/1) Thr-Phe 0,176 Thr-Phe 0,175 Thr-Phe-Phe 0,067 Thr-Phe-Phe-HCl 0,037 Thr-Phe-Phe-HCl 0,047 Thr-Phe-Phe 0,025 Enzim (g/1) tripszin : tripszines sziliciumdioxid : liziléndopeptidázos sziliciumdioxid: 2,7 808 5 77 157 157 Közeg (% szerves frakció) 60 60 67 60 60 60 pH 6,2 6,5 6,5 6,3 6,5 6,5 Reakcióidő (óra) 1/3 1 7/12 48 3 3 Hozam (az elméleti %-a) 53 28 54 38 27 16
