189268. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán inzulin szemiszintetikus előállítására
1 189 268 2 zatban ismertetjük a kötési reakció termékei retenciós idejének a DAI retenciós idejétől való eltéréseként (ARf) megadva. A táblázatból látható, hogy a ARf értékek az ismert termékekénél jóval nagyobbak. 2. Táblázat DAl-hoz kapcsolt csoport AR, (s) thr-O-metil 220 thr-O-terc-butil 1000 thr-phe-O-metil 1400 thr-phe-phe 1700 Ez a reagálatlan DAI és a módosított inzulin elválasztását megkönnyíti, tisztább termék előállítását teszi lehetővé. (S’. Pc Ida A kötött phc-phc-csoport eltávolítása DAI tlir-phe-phe-ról Az át nem alakult DAI és a kötési reakció termékeként nyert DAl-thr-phe-phe hidrofób oszlopon való elválasztása révén 23 ml térfogatú frakciót kapunk, amely 0,85 mg/mi kötött terméket tartalmaz. Ezt a terméket fagyasztva szárítjuk, majd közelítőleg 2,8 mg/ml koncentrációjúra oldjuk 0,2 mól/l-es pH 8,5 ammónium-hidrogén-karbonát pufferben. Ehhez az oldathoz 2 pl karboxipeptidázoldatot adunk (2,3 E). A reakciót 30 perc elteltével azonos térfogatú 0,5 mól/I citromsav hozzáadásával leállítjuk. Ezután a kapott anyagot kristályosítjuk. Az aminosavanalízissel végzett vizsgálatok azt mutatják, hogy a kötési reakció terméke teljes egészében humán inzulinná alakul. Kristályosítást követően a felülúszóban kizárólagos aminosavként fenilalanin mutatható ki. A hozam > 99%. A kapott inzulin tisztasága > 99%. 9. Példa 190 mg treonin-fenilalanin-metil-észtert 1 ml 1 : 1 arányú dimetii-formamid - etanol elegyben oldunk. A kapott oldatból 0,2 ml-t 19,4 mg DAI- hoz adunk. Ezt követően 0,1 ml tripszin oldatot (6 mg tripszint 1 ml 0,5 mól/l-es, pH 6,5-ös trisz/ hidrogén-klorid pufferben oldunk) és 0,04 ml 1 mól/l-es nátrium-hidroxid-oldatot adunk a dipeptidoldathoz, majd az elegy pH-ját 6,8-re állítjuk. 18 órán át tartó inkubálást követően 25%-os hozammal nyerjük a DAI-thr-phe-O-metil vegyületet. 10. Példa DAl-thr-phe-t a 8. példában a DAI-thr-phe-phe kezelésénél ismertetett módon karboxipeptidázzal (0,9 E) kezelünk. 1 óra elteltével a DAI-thr-phe teljes egészében humán inzulinná alakul. Az áu kulást nagynyomású folyadékkromatográfiás víz. gálattal igazoltuk. A hozam > 99%. A kapott termék tisztasága >99%. 11. Példa Az 1-6. példákban ismertetetthez hasonló módon DAI-thr-phe-phe-O-metil-t állítunk elő. A reakció körülményei: 40,7 g/1 DAI, l,0mól/l thrphe-phe-O-metil, 1,8 g/1 tripszin, 60% szerves frakció pH 6,6-os közegben, a reakcióidő 1 óra. A reakció hozama 86%. 12. Példa DAI-thr-phe-phe-O-metilt a 7. példában ismertetett módon kezelünk. A DAl-hoz kapcsolt csoport retenciós ideje és a DAI retenciós ideje közötti különbség R^s) = 2000. 13. Példa DAI-thr-phe-phe-O-metilt és DAI-thr-phe-O- metilt a 8. példában a DAI-thr-phe-O-metilre megadott módon kezelünk. Az ott kapottal azonos eredményre jutunk, a humán inzulinná való átalakulás tökéletes, és fenilalaninon kívül más aminosav nem mutatható ki. Hozam: > 99%. A kapott inzulin tisztasága > 99%. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás humán inzulin szemiszintetikus előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely (II) általános képletű vegyületet - ahol R1 jelentése valamely aminosav, peptid vagy ezek amidja vagy észtere - dez(B 30) inzulinnal vagy dez(B 30) inzulin maradékkal reagáltatunk, a kapott (I) általános képletü módosított humán inzulinról - ahol R' jelentése a (II) általános képletnél megadott - az R1 csoportot karboxipeptidáz enzimmel lehasítjuk, majd a kapott humán inzulint elkülönítjük. Elsőbbsége: 1982. 04. 21. 2. Eljárás humán inzulin szemiszintetikus előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely (III) általános képletü vegyületet - ahol R1 jelentése valamely aminosav vagy peptid vagy ezek amidja vagy észtere - dez(B 29, B 30) - inzulinnal reagáltatunk, és a kapott (I) általános képletű módosított humán inzulinról - ahol R1 jelentése a (III) általános képletnél megadott - az R1 csoportot karboxipeptidáz enzimmel lehasítjuk, majd a kapott humán inzulint elkülönítjük. Elsőbbsége: 1983. 04. 21. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy R1 helyettesítőként aminosavat, dipeptidet vagy tripeptidet vagy ezek észterét vagy amidját tartalmazó (II) általános képletű vegyületet alkalmazunk. Elsőbbsége: 1982. 04. 21. 4. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy R1 helyettesítőként aminosavat, dipeptidet 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
