189268. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán inzulin szemiszintetikus előállítására
1 189 268 2 A találmány tárgya új eljárás humán inzulin szemiszintetikus előállítására. A találmány szerint új, módosított humán inzulint állítunk elő, majd ebből a módosító csoportot eltávolítva nyerjük a humán inzulint. A vérben jelentkező inzulinhiány (diabetes mellitus) következtében fellépő hipoglikémia inzulin adagolással, például injekció formájában vagy adagoló pumpa segítségével, kezelhető. Erre a célra különösen elterjedten használják az állati pankreászból, például sertés vagy marha pankreászból izolált inzulint. Az ilyen inzulinkészítmények egyes esetekben antigén vagy allergén aktivitással bírnak. Ezt részben a készítményben jelenlévő szennyezések (például pro-inzulin, ennek részleges bomlástermékei, arginin-inzulin, inzulin-etil-észter, monodezaminoinzulin vagy inzulin aggregátumok) okozhatják. Ezen felül az allergén aktivitás az állati és a humán inzulin szerkezete közötti különbség következménye is lehet annak eredményeképpen, hogy az emberi szervezet nem fogadja be az állati eredetű fehérjét. A sertés és a humán inzulin például egy aminosavban, az úgynevezett B-lánc karboxiterminális aminosavában különbözik egymástól. Ez az úgynevezett B 30 aminosav a sertés inzulinban alanin, a humán inzulinban pedig treonin. Ezért a sertés inzulin a B 30 aminosav treoninra való cserélésével alakítható humán inzulinná. E feladat megoldására számos eljárás ismeretes. Természetes módon szinte minden eljárás a B 30 aminosav eltávolításával kezdődik; a sertés inzulin esetében így az alanint távolítják el. Az így előállított dez(B 30) inzulint gyakran nevezik dez(Ala) inzulinnak, röviden DAI-nak. Az eljárás folytatásaként számos, a humán inzulin keletkezéséhez vezető eljárás ismeretes. Ezek védett - például észterrel védett - karboxilcsoporttal bíró treoninnak enzimes vagy nem enzimes eljárással dez(B 30) inzulinhoz való kötésén alapulnak. A treonin kötődése után a védőcsoportot el kell távolítani. Egy szokásosan alkalmazott védőcsoport, a terc-butoxicsoport esetében a védőcsoport eltávolításához igen drasztikus körülmények szükségesek, főként szélsőséges pH, amely a visszamaradó inzulinmolekulára is hat. E hatás eredményeként az inzulin részleges lebomlásának termékei jönnek létre, melyek gyakorlatilag elválaszthatatlanok a célterméktől, a humán inzulintól. Ennek folytán a kapott termék tisztasága nem megfelelő. A tisztítás már az eljárás korábbi szakaszában a treonin kötését követően reagált és a reakcióban részt nem vett dez(B 30) inzulin elválasztása során is jelentős problémát okoz. Az elválasztással, különösen nagy léptékű gyártásnál, nem lehet megfelelően tiszta terméket nyerni, kivéve, ha igen nagy veszteségek fellépését vállaljuk. Humán inzulin szemiszintetikus előállítására szolgáló eljárást ismertetnek a 4 320 196 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban. Az ismert eljárásban a DAI-t Thr-O-alkillel reagáitatják. Ebben az eljárásban a reakcióban résztvett és a reagálatban DAI elválasztása - amely a kívánt termék tisztaságára is kihat - nem kielégítő. Ennek oka, hogy az elválasztandó termékek retenciós ideje közötti különbség nem elég nagy. erre vonatkozó mérési adatainkat a találmány szv rinti vegyületekkel való összehasonlításban a 2. táblázatban ismertetjük. Az ismert eljárásban az alkilcsoportot a Thr-O- alkillal kapcsolt DAI-ról meglehetősen agresszív módszerrel, trifluor-ecetsavval hasítják le. A reakció hozama 43%, a kapott termék tisztasága 77%. Célul tűztük ki az ismertnél jobb hozamú, tisztább terméket biztosító eljárás kidolgozását. Találmányunk olyan eljárást biztosít 99%-nál nagyobb tisztaságú humán inzulin előállítására, amely nem tartalmaz nagyszámú, a hozamot csökkentő elválasztási és tisztítási műveletet. A DAI-Thr-R1 vegyületröl, amelyben R1 a Thrhez peptidkötéssel kapcsolódik, az R1 csoport a peptidkötés hasításával > 99% hozammal távolítható el, ellentétben a fenti, ismert eljárásban alkalmazott észterkötés hasításának kisebb hozamával. A találmány szerinti eljárásban az (I) általános képletű módosított humán inzulinról - a képletben R1 jelentése aminosav vagy peptid vagy ezek észtere vagy amidja - enzimesen lehasítjuk az aminosavat vagy peptidet - majd az így kapott humán inzulint elkülönítjük a közegből. Az (I) általános képlettel jellemzett módosított humán inzulin könnyen előállítható dez(B 30) inzulinnak (II) általános képletű vagy dez(B 29, B 30) inzulinnak (III) általános képletű vegyülettel való összekötésével. A (II) és (III) képletekben R1 jelentése az előzőekben megadott. A dez(B 30) inzulin a humán inzulinnal a B 30 aminosavtól eltekintve mindenben azonos állati inzulinból, azt megfelelő enzimmel, például karboxipeptidáz A enzimmel vagy Achromobacter lyticusból származó liziléndopeptidázzal kezelve elkülönítetten előállítható. A dez(B 30) inzulin-maradék előállítható in situ, de a B 30 aminosav eltávolítása és a (II) általános képletű vegyület kötése úgynevezett transzpeptidáz reakcióban egyetlen enzimmel, például tripszinnel elvégezhető. A dez(B 29, B 30) inzulin ugyancsak előállítható a megfelelő állati inzulinból dipeptidáz enzim alkalmazásával vagy olyan peptidáz segítségével, amely specifikusan a prolin-lizin peptidkötést hasítja. A (II) általános képletű vegyület az előzőek szerint készített dez(B 30) inzulin B 29-lizinjéhez például tripszinnel vagy bármely más tripszinhez hasonló hatású enzimmel, például liziléndopeptidázzal hozzáköthető. Hordozóhoz kötött enzim akkor használható, ha a reakció végeztével az enzim és a módosított inzulint tartalmazó oldat könnyen elválasztható egymástól. Az R1 csoport és a humán inzulin közötti kovalens kötésnek enzimesen hasíthatónak kell lennie. Ez a feltétel jelentősen befolyásolja az R1 csoportot alkotó aminosav(ak) megválasztását. Ha R1 aminosavból vagy aminosavakból áll, előnyösen egy aminosavból álló részt vagy di- vagy trípeptidet választunk. Ezek lehetnek például hidrofób aminosavak, mint a fenilalanin vagy a triptofán és/vagy töltéssel bíró aminosavak, mint az arginin vagy a lizin. Ha hidrofób aminosavakat használunk, a tisztítást jelentősen elősegítik a hidrofób 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
