189251. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tumor nekrózis faktor stabilizálására
1 .189 251 2 A találmány tárgya eljárás tumor nekrózis faktor stabilizálására. A találmány közelebbről eljárás tumor nekrózis faktor (a továbbiakban TNF) stabil vizes oldat vagy stabil por formában történő előál-. lítására. Carswell és munkatársai fedezték fel a TNF-et. Beszámoltak róla, hogy a TNF immunpotenciátorokkal - pl. Calmette-Guérin bacillus (BCG), Corynebacteriumok vagy Zymosan - előkezelt egerek, patkányok vagy nyulak szérumában jelenik meg endotoxin kezelés hatására. Beszámoltak továbbá arról is, hogy a TNF egy sor transzplantált egértumor nekrózisát idézi elő anélkül, hogy ártalmas volna a gazdaszervezetre [Proc. Nat. Acad. Sei. USA 72 (9), 3666-70 (1975)]. Később számos közlemény látott napvilágot az egér és nyúl TNF fizikai és biokémiai tulajdonságairól [pl.: Proc. Nat. Acad. Sei. USA 73 (2) 381-5 (1976); Expl. Cell. Bioi. 47 53-60 (1979); Br. J. Cancer 38 302-9 (1978), valamint uo. 42 416-22 (1980)]. Megjegyzendő, hogy egy citotoxikus faktor, amely feltételezhetően azonos a TNF-el, szintén több közleményben szerepel [Pl.: Infect. Immun. 28 (1) 204-11 (1980)]. A TNF in vitro előállítását is ismertették már. Például Matthews meghatározta és leírta a normál, illetve BCG-vel kezelt nyulak különböző szöveteiből származó egymagvú fagocitákkal való TNF előállítás optimális körülményeit [Br. J. Cancer 44 418-24 (1981)]. A cikk szerint optimális mennyiségű TNF endotoxin jelenlétében állítható elő az egymagvú fagocitákkal, és úgy találták, hogy a leghatásosabb TNF termelők az alveoláris és peritoneális makrofágok. A cikkből azt is megtudhatjuk, hogy a BCG-vel kezelt nyulak makrofágjai szignifikánsan több TNF-et állítanak elő, mint a kezeletlen állatokból származók. Időközben Männel és munkatársai közölték, hogy a BCG-vel fertőzött egerek makrofágban dúsított, hashártya váladékból származó sejtjei in vitro lipopoliszacharid (endotoxin) hatására citotoxikus faktort választanak ki [Infect. Immun. 30 (2) 523-30 (1980) és uo. 33 (1) 156-64 (1981)]. Ami a TNF jellemző tulajdonságait illeti ismertes, hogy a TNF sokféle tumorra gyakorolt nekrotizáló hatását az élőlények fajától függetlenül fejti ki. Például a nyúl TNF nekrózist idéz elő egér tumoroknál. Továbbá ismeretes az is, hogy a TNF in vitro semmilyen toxikus hatással sem rendelkezik a normális sejtekre, viszont citotoxikus hatású bizonyos fajta neoplasztikus sejtvonalakra (pl.: L-M és Meth-A sejtek). A fentieket összefoglalva, a TNF antitumor hatású, hatását fajtól függetlenül fejti ki, és a legkevésbé sem ártalmas a normális sejtekre. Ezért a TNF tumorellénes gyógyszerként való klinikai alkalmazásához szakmai körökben igen nagy reményeket fűznek. Az is ismeretes, hogy emlősökben vagy szövettenyészeteiben csak igen kevés TNF keletkezik. Ennek megfelelően ahhoz, hogy a TNF tumorellenes gyógyszerként széleskörűen és biztonságosan klinikailag alkalmazható legyen, okvetlenül szükséges az emlősökben és szővettenyészetekben keletkező nyers TNF izolálása és nagymérvű tisztítása. Továbbá midőn a tumorellenes gyógyszerként alkalmazásra kerülő TNF nagyüzemi előállítása megvalósul, általában szükségessé válik a nagytisztaságú TNF hosszabb időn át való tárolása oldat vagy fagyasztott formában, illetőleg a TNF oldat fagyasztva szárítása. A találmány feltalálói azonban úgy találták, hogy a nagytisztaságú TNF aktivitása a tárolás, fagyasztás, olvasztás és fagyasztva szárítás során jelentősen csökken. A feltalálók tudomása szerint eddig még nem jelent meg a nagytisztaságú TNF stabilitásával foglalkozó közlemény. Ilyen körülmények között a nagytisztaságú TNF-ből megfelelő és állandó ellátás - különösen kereskedelmi méretekben - nem biztosítható, annak ellenére, hogy tudjuk, hogy a TNF hatásos tumorellenes gyógyszer. A fentiekben vázolt, a TNF instabilitására vonatkozó nehézségek leküzdésére a feltalálók kiterjedt és mélyreható kutatásokat folytattak. Meglepő módon azt tapasztalták, hogy egy bizonyos fehérje megfelelő mennyiségben stabilizáló szerként a TNF tartalmú vizes oldathoz adva lehetővé teszi a TN F aktivitásvesztés nélküli hosszabb ideig történő tárolását és stabilizálja a TNF-et a fagyasztás, olvasztás, fagyasztva szárítás és a hasonló műveletek során is. A találmány tárgya eljárás TNF stabilizálására. A találmányt a következő részletes leírással és a mellékelt ábrákkal szemléltetjük: 1. ábra Az emberi szérumaibumin koncentrációjának a +4 'C-on 1 napig tárolt TNF maradék aktivitására gyakorolt hatását bemutató grafikon. 2. ábra A részlegesen hidrolizált zselatin koncentrációjának a +4 °C-on 7 napig tárolt TNF maradék aktivitására gyakorolt hatását bemutató grafikon. 3. ábra Az emberi gamma-globulin koncentrációjának a +4 °C-on 7 napig tárolt TNF maradék aktivitására gyakorolt hatását bemutató grafikon. 4. ábra A lazac protamin szulfát koncentrációjának a +4 'C-on 7 napig tárolt TNF maradék aktivitására gyakorolt hatását bemutató grafikon. Az ábrák rovábbi részletes magyarázatára később a 2. példa kapcsán kerül sor. A találmány eljárást nyújt TNF stabilizálására oly módon, hogy a TNF tartalmú vizes oldathoz legalább egy - albumin, zselatin, globulin, protamin és protaminsó közül választott - stabilizálószer megfelelő mennyiségét adjuk. Az itt használt TNF megnevezés fiziológiailag aktív anyagot jelent, amely egyrészt oly módon állítható elő, hogy a legalább egy reticulo-endothel rendszert (RÉS) stimulálni képes anyaggal előkezelt emlősökbe Gram-negativ baktériumból származó endotoxint injektálunk, másrészt pedig úgy juthatunk hozzá, hogy emlősökből származó aktivált makrofágokat tartalmazó szövetkultúrákhoz Gram-negativ baktériumból származó endotoxint adunk. A TNF olyan anyag, amely tumoros emlősökbe passzívan bejuttatva némely tumor nekrózisát idézi elő, vagyolyan tetszőleges módon előállított anyag, amely a fentiekben ismertetett fiziológiailag aktív anyaghoz hasonló tulajdonságokkal rehdelkezik. I! 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 ~>
