189251. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tumor nekrózis faktor stabilizálására
1 189 251 2 A találmány szerinti eljárásban alkalmazásra kerülő TNF előállítására több módszer is ismeretes, így például Matthews és munkatársainak eljárása [Br. J. Cancer 42 416-22 (1980)], valamint a Green és munkatársai által kidolgozott eljárás [J. Natl. Cancer Insti 59 (5) 1519-22 (1977)]. A találmány szerinti eljárásban TNF előállítására a következő jellegzetes eljárásokat alkalmaztuk. Először is legalább egy, a reticulo-endothel rendszer (RÉS) stimulánsára képes anyagot injektáltunk intravénásán vagy intraperitoneálisan emlősbe (pl. egér, nyúl, tengeri malac stb.). A RES-t stimuláló anyagként általában Gram-pozitív baktériumok, protozoonok vagy élesztők alkalmasak, amelyek egyaránt lehetnek élő vagy elölt (pl. hő-, illetve formalinos kezeléssel) mikroorganizmusok, vagy mikrobasejt kivonatok. Gram-pozitív baktériumként például Propionibacteriumok így Propionibacterium acnes (Corynebacterium parvum) és Propionibacterium granulosum (Corynebacterium granulosum), Mycobacteriumok, igy a Calmette- Guérin (BCG) bacillus és Mycobacterium smegmatis, valamint Nocardiák, így Nocardia erythropolis és Nocardia gardneri alkalmasak. Megfelelő protozoonok például a Plamodium és Toxoplasma fajok, az élesztőkre pedig egyebek között jó példa a Saccharomyces cerevisiaeből extrahált Zymosan. Erre a célra egyébként szintetikus makromolekulák (igy például pirán-kopolimer) is alkalmazhatók. Másodszor, 7-15 nappal az említett RES-t stimuláló anyaggal történt kezelést követően Gramnegatív baktériumból származó endotoxint (pl. Escherichia coliból, Pseudomonas aeruginosából vagy Salmonella typhosából származó lipopoliszacharidot) injektáltunk intravénásán az emlősbe. Harmadszor, 1,5-2 órával az injektálás után kinyerjük az emlős testnedveit (pl. hasvíz, nyirok stb.) és/vagy szérumját vagy plazmáját; vagy pedig homogenizáltuk és fiziológiás sóoldattal extraháltuk a belső szerveket (pl. máj, lép stb.). Ezek a testnedvek, szérum, plazma és/vagy belső szerv kivonatok szolgáltak nyers TNF oldatként. Közülük mégis általában a szérum vagy a plazma használatos. A találmány szerinti eljárásban alkalmazott TN F előállítási módszere azonban - mint már említettük - nem korlátozódik a fenti eljárásra. A génmanipuláción vagy a szövettenyésztésen alapuló, TNF termelő sejteket hasznosító eljárások szintén eredményesen alkalmazhatók. Megjegyzendő, hogy ezek a módszerek humán TNF előállítására is alkalmasak. A nyers TNF, amint a fenti módszerek bármelyikével állítottak elő, a következő szokványos biokémiai műveletekkel külön-külön, vagy azok kombinálásával tisztítható és ennek eredményeként tisztított TNF oldatot, ezt fagyasztva szárítva pedig tisztított TNF port kapunk. A TNF tisztítására alkalmas biokémiai műveletekként a következők említhetők: ammónium-szulfátos kisózás, ioncserés kromatográfia anioncserélő gyantán, gélszürés és elektroforézis. Ezeknek a módszereknek az alkalmazása során a TNF tisztasága növekszik, de fokozatos stabilitáscsökkenés észlelhető. Például egy 500 ezer egység/mg fehérje fajlagos aktivitásig tisztított (a TNF aktivitás egység fogalmát később definiáljuk) TNF minta már meglehetősen instabil, amint ezt a példákban közölt adatokból látszik. Még az ennél alacsonyabb fajlagos aktivitású minták is némileg veszítenek aktivitásukból, ha tárolják, fagyasztják, olvasztják, fagyasztva szárítják őket, vagy egyéb műveleteket végeznek velük. Ennek megfelelően a találmány célja a nagy tisztaságú és igy instabillá vált TNF stabilizálása. Előnyös, ha a stabilizálandó TNF készítmény oldat. A találmány értelmében előnyös, ha a stabilizálandó TNF oldat pH-ja állandóan 5- és 10 közötti érték, továbbá, ha az oldószer valamilyen alkalmas puffer. Ilyen alkalmas pufferként említhető például a foszfátpuffer, valamint a trisz(hidroximetil)amino-metán (HC1 puffer). Kívánt esetben sót, például nátrium- vagy kálium-kloridot adunk a TNF- oldathoz. Sót adunk például a TNF oldathoz, ha injekció készítéséhez izotóniás oldatot kívánunk előállítani, de nem csupán e célból történhet sóadagolás. A TNF oldat sókoncentrációját a sóadagolás céljának megfelelően választjuk meg. Ha például a TNF oldatból injekció készül, akkor 0,15 mólos izotóniás nátrium-klorid oldatot készítünk belőle. A találmány értelmében eljárva legalább egy - albumin, zselatin, globulin, protamin és protaminsó közül választott - stabilizálószer megfelelő mennyiségét adjuk a TNF-et tartalmazó vizes oldathoz. Alkalmas albuminként különböző állatokról (pl. marha, ló, birka, kecske, csirke) és emberből származó albuminokat említhetjük. A megfelelő albumin konkrét példái a következők: marha szérumalbumin, humán szérumalbumin, csirke tojásalbumin, marha laktalbumin és humán laktalbumin. Az említett albuminok között nem észleltek számottevő különbséget a TNF stabilizáló képesség tekintetében. Injekció készítésére azonban a legelőnyösebb stabilizálószer a humán szérumalbumin. Alkalmas zselatinként a szokásos módon előállított közönséges zselatint, valamint a részlegesen hidrolizált zselatint említhetjük. A zselatin molekulasúlya nem lényeges. Injekció készítéséhez azonban a részlegesen hidrolizált, vízoldható zselatin a legelőnyösebb stabilizálószer. A részlegesen hidrolizált zselatin proteolitikus enzimekkel (pl. papain) végzett enzimatikus hidrolízissel, vagy savas vagy lúgos hidrolízissel állítható elő. Alkalmas globulinként különböző emlősökből (pl. marha, ló, birka, kecske) származó, valamint emberi eredetű globulinok és származékaik említhetők. A felsorolt globulinok között a TNF stabilizáló képesség vonatkozásában számottevő különbség nem észlelhető. Előnyösen közülük mégis gamma-globulint, illetve ennek enzimes kezeléssel vagy kémiai módosítással előállított származékát használhatjuk, injekció készítéséhez pedig stabilizátorként legelőnyösebbek a humán gamma-globulin, valamint származékai, mint például a plazminnal vagy pepszinnel kezelt humán gamma-globulin vagy a szulfonált humán gamma-globulin. Alkalmas protaminként megfelelő halfajok (pl. lazac, hering, makréla) protaminjai említhetők. Alkalmas 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
