189222. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új, fertőző bronchitis elleni vakcina előállítására
1 189 222 2 toisz-üregben. A tojásokat 18-24 óra múlva gyertyával átvilágítjuk, és a nem tipikus, elpusztult embriókat eldobjuk. 18-72 órás inkubációs periódus után (az alkalmazott vírus-törzstől függően) az AAF-et kinyerjük, centrifugálással tisztítjuk és/ vagy szűrjük, és esetenként a megfelelő mennyiségű antibiotikummal keverjük, ha ez szükségesnek látszik. B. A vakcina készítése Az AAF-et ezt követően ismert módon gyógyászati készítménnyé alakítjuk. A stabilizálást megfe: lelő stabilizálószerek segítségével hajthatjuk végre, ilyenek a szénhidrátok, pl. a szörbit, mannit, vagy a fehérjék, mint pl. az albumin, kazein, vagy megfelelő keverékeik. Az AAF nagyobb mennyiségét hűthetjük -35°C alá és ilyen módon tárolhatjuk a további felhasználásig. Egy másik módszer szerint az AAF nagyobb mennyiségét +4 °C-on tárolhatjuk a további felhasználásig. Az egyes tételekből mintákat veszünk vírus-tártalom vizsgálatra. A stabilizált AAF-et (ha fagyasztott mintákról van szó, felengedés után) liofilizáló ampullákba töltjük 1-2 ml-es mennyiségekben. A vírus-tartalmat olyan módon állítjuk be, hogy a liofilizálás után a titer legalább 4,0 log EID50 legyen madárdózisonként. A liofilizálás után az ampullákat vákuumban vagy nitrogén-atmoszférában forrasztjuk le. III. Példa Inaktivált vakcina A. A vírus készítése A vírust a II. példa A. részében leírt módon szaporítjuk. Nagyobb tömegű vírus tárolását az inaktiválás és a további műveleti lépések előtt -35°C-nál alacsonyabb hőmérsékleten végezhetjük., B. A vírus inaktiválása A fagyasztott AAF-et felengedtetjük, a vírustiter (EIDjo) meghatározásához mintát veszünk; az AAF-et annyi formaiinnal inaktiváljuk, hogy a végső formaldehid-koncentráció 0,4% legyen. 24 óra szobahőmérsékleten tartás után a formaiint nátrium-metabiszulfittal semlegesítjük. Az inaktiválódás mértékének vizsgálatára mintát veszünk, és ezzel inokulálunk fogékony SPF-csirke embriókat vagy CEF-tenyészetet legalább egy passzálással. Egy másik módszer szerint az inaktiválást ßpropiolaktonnal, etilén-iminnel vagy ezek származékaival végezzük. Az inaktivált AAF-et hígítjuk vagy koncentráljuk a szükséges titernek megfelelően. A koncentrálás elvégezhető az inaktiválás előtt is. A koncentrálás alkalmas módja pl. az ultraszűrés vagy precipitálás polietilénglikollal. Az inaktivált AAF-et +4 °C-on lehet tárolni. C. A vakcina készítése Inaktivált olajemulziós vakcina készítéséhez Tween(R>80-at adunk, az inaktivált antigén szuszpenzió 3,5%-ának megfelelő koncentrációban. Az antigén-tartalmat legalább 7,0 log EID50-re állítjuk be madár-dózisonként. Az antigén-mennyiséget enzimimmun meghatározással mérhetjük. A szuszpenziót ez után az adjuváns olajos fázisával emulzióba visszük olyan módon, hogy az olaj-víz arány 70 : 30 vagy 55 :45 legyen. Az adjuváns ösz^ szetétele: Marcol(R,52 90% Tween(R>80 3,5% Span<R)80 6,5% A vizes fázis átlagos részecskemérete kevesebb, mint 1,0 pm. IV. Példa Kombinált vakcina A. Kombinált élő vakcina Az élő kombinált vakcina előállításához a II. példa szerint előállított, különböző vírus-törzseket tartalmazó AAF-eket kombinálunk, olyan módon, hogy az egyes törzsekre megkívánt minimális vírustartalom legyen meg a végtermékben. B. Kombinált inaktivált vakcina A vírus törzset a II. példa A. része szerint szaporítjuk, és -35 °C-on tároljuk. A megfelelő virus törzsek antigénjeit a III. példa B. része szerint inaktiváljuk, majd + 4°C hőmérsékleten tároljuk. Tween(R)80-at, 3,5% koncentrációig, adunk a megfelelő antigén-szuszpenzióhoz. A vírus-szuszpenziók antigén-tartalmát olyan módon állítjuk be, hogy minden egyes vírus-törzsre madár-dózisonként az antigén-ekvivalens legalább 7,0 log EID50 legyen. A polivalens vakcinával a III. példa C. részében leírtak szerint emulziót képzünk. A vizes fázist össze lehet keverni az egyes törzsek szuszpenziójából az emulzió kialakítása előtt, vagy az egyes antigéneket külön lehet emulzióba vinni az összekeverés előtt. V. Példa A csirke eritrociták hemagglutinálása Két térfogat, az I. példa A. része szerint előállított fertőzött AAF-et vagy fertőzött szövettenyészet felülúszót szobahőmérsékleten összekeverünk 1 rész 2%-os csirke eritrocita szuszpenzióval. Az agglutinálás kb. 2 percen belül, esetenként 5 percen belül bekövetkezik. A hemagglutinálást gyorsítani lehet +4 °C-on történő inkubálással. A hemagglutinin a vírus-részecskékhez kapcsolódik, amelyet bromelin-kezeiéssel ki lehet mutatni. VI. Példa A hemagglutinálás gátlása (Hl) A. Azt, hogy a csirke-eritrociták új FB törzsek által okozott hemagglutinálása fajlagos és a vírus antigénnek tulajdonítható, a hemagglutinálási reakció gátlásával mutathatjuk be, amely gátlást a megfelelő vírus ellen fajlagos antiszérumnak az eritrocitákhoz történő hozzáadás előtti beadásával idézhetünk elő. Az SPF tojásokat D-274 hemagglutináló törzsekkel inkubáljuk, 48 óra inkubálás után az AAF-et kinyerjük. A kezeletlen AAF-et önmagában használjuk, vagy 1 : 1 arányba hígítva szérummal vagy antiszé-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
