189204. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kolecisztokinin-oktapeptid-szulfátészter és sói előállítására
1 189 204 2 A találmány tárgya új eljárás az (I) képletű kolecisztokinin-oktapeptid-szulfátészter és sói előállítására. L-Asp-L-Tyr-L-Met-Gly-L-Trp-L-Met-L-Asp-L-Phe—NH2(I) S03X - ahol X = hidrogénatom vagy alkálifémion. A kolecisztokinin-oktapeptid (I) a 33 aminosavból álló kolecisztokinin-pankreozimin hormon aktív centruma. Önállóan is előfordul a központi idegrendszerben és a vékonybélben, különösen nagy mennyiségben izolálható az agykéregből. Ondetti vizsgálata szerint az (I) képletű vegyület moláris alapon számolva egy nagyságrenddel hatásosabb a 33 aminosav-tagszámú molekulánál. Számos biológiai aktivitásából először az epehólyag kontrakcióját okozó ún. kolecisztokinetikus hatás, valamint a pankreász enzim szekrécióját fokozó ún. pankreozimin hatás vált ismertté [Amer. J. P- hysiol. 86,599 (1928); J. Physiol. 102, 115 (1943)]. A kolecisztokinin-oktapeptid a sphincter Oddira erős relaxáló hatást gyakorol [J. Amer. Digestive Diseases 15, 149 (1970)], s fokozza a bélmotilitást. A kolecísztokinin-oktapeptidnek gasztrointesztinális hatásain túl az utóbbi időben számos központi idegrendszeri hatása vált ismertté: befolyásolja a hipotalamusz éhségközpontjának működését és különböző neurotranszmittereket mobilizál az agy egyes régióiban. A legújabb irodalmi adatok szerint jól alkalmazható skizofrénia kezelésére is. A fentiek alapján a készítmény diagnosztikus értékén túl (epehólyag vizsgálat) terápiásán is jelentőssé válhat. A kolecisztokinin-oktapeptid előállítása több cikkből és szabadalomból is ismert (Ondetti és mtsai: J. Am. Chem. Soc. 92, 195 (1970); 1 922 185 sz. Német Szövetségi Köztársaság-beli nyilvánosságrahozatali irat; Penke és mtsai: 174 500 sz. magyar szabadalmi leírás). Az ismert eljárások közös vonása, hogy a kolecisztokininoktapeptid-szulfátésztert védett oktapeptidből szulfátészterezéssel, majd azt követően a védőcsoportok eltávolításával állítják elő. Az így nyert terméket a korábban ismert analitikai módszerek (elektroforézis, TLC) egységesnek mutatták, de az újabban végzett nagynyomású kromatográfiás vizsgálatok szerint jelentős mennyiségű szennyezést (főleg szulfonált tirozin-tartalmú származékokat) tartalmaznak. A szennyező melléktermékek keletkezése arra vezethető vissza, hogy a szulfátészter-képzéshez használt reagensek (H2S04, piridinkéntrioxid, klór-szulfonsav) túlságosan reakcióképesek, s az aminosavakat szulfonálják, sőt oxidálják. Azt találtuk, hogy egy új, az eddigieknél kíméletesebb szulfatáló reagens, az acetilkénsav-piridinium só ch3—co—oso3 o c6h6n © alkalmazásával elkerülhető a tirozin és a tirozint tartalmazó peptidek szulfonálódása illetve oxidációja. Ezzel a reagenssel szulfátészterezve a megfelelően védett L-tirozint vagy L-aszparaginil-L-tirozint, nagyon tiszta, a további szintézisekre közvetlenül alkalmas származékok állíthatók elő. Az (I) képletű kolecisztokinin-oktapeptid-szulfátésztert tehát a C-terminális hexapeptidből kiindulva két lépésben a megfelelően védett L-tirozinszulfátészter és L-aszparaginsav, vagy egy lépésben L-aszparaginil-L-tirozin-szulfátészter alkalmas származéka segítségével építjük fel. (A C-terminális hexapeptid előállítása le van írva a fent ismertetett Ondetti cikkben. A kapcsolódó komponens előállítását pedig Guttmann és mtsai ismertetik a Helv. Chim. Acta 44, 721 (1961) cikkében.) A találmány tárgya tehát új eljárás az (I) általános képletű kolecisztokinin-oktapeptid-szulfátészterek előállítására - ahol a képletben X hidrogénatomot vagy alkálifémiont jelent. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy a) a (II) képletű hexapeptidet L-Met-Gly-L-Trp-L-Met-L-Asp-L-Phe—NH2 (II) (III) általános képletű védett dipeptid-hidraziddal Y-L-Asp-L-Tyr-N2H3 (III) S03X- a képletben X jelentése a fenti és Y lúggal lehasítható, savra azonban rezisztens, ismert védőcsoportot, célszerűen fluorenil-metil-oxi-karbonil-csoportot vagy o-hidroxi-fenil-oxi-karbonil-csoportot jelent - reagáltatjuk azid-vegyületen keresztül, vagy b) a (II) képletű hexapeptidet adott esetben aktivált karboxilcsoportot tartalmazó Y-O-szulfáto-LTyr-al vagy alkalifémsójával - a képletben Y jelentése a fenti - reagáltatjuk, a kapott termék Y védőcsoportját lehasítjuk, majd a képződött (V) általános képletű heptapeptidet L-Tyr-L-Met-Gly-L-Trp-L-Met-L-Asp-L-Phe—NH2 (V) so3x - a képletben X jelentése a fenti - lúggal lehasítható, savra azonban rezisztens védőcsoporttal, célszerűen fluorenil-metil-oxi-karbonil-csoporttal védett aszparaginsavval reagáltatjuk, végül az a) vagy b) eljárásváltozat szerinti kapott (IV) általános képletü védett oktapeptid-származék Y-L-Asp-LTyr-L-Met-Gly-L-Trp-L-Met-L-Asp-L-Phe—NH2 (IV) so3x- a képletben X és Y jelentése a fenti - Y védőcsoportját lehasítjuk, és a képződött (I) általános képletű kolecisztokinin-oktapeptid-szulfátésztert sav (X = hidrogénatom) vagy só (X = alkálifémion) formájában elkülönítjük. A (IV) általános képletű védett oktapeptidről az Y védőcsoportot lúgos kezeléssel hasíthatjuk le. A védőcsoport eltávolítására 1 n NaOH és dioxán elegye, illetve 10% piperidint tartalmazó dimetilformamid egyaránt alkalmas. A kiindulási anyagként használt (II) képletű hexapeptidet a peptidkémiában ismert módszerek valamelyikével, pl. dipeptidekből fragmenskondenzációval állítjuk elő, amikor a vegyes anhidrides, azidos és aktív észteres technikát alkalmazhatjuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
