189204. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kolecisztokinin-oktapeptid-szulfátészter és sói előállítására
1 189 204 2 Az Y helyén fluorenil-metil-oxi-karbonilcsoportot tartalmazó (III) általános képletű vegyületeket - amelyek új anyagok - célszerűen a következőképpen állítjuk elő: Az irodalomból ismert benziloxi-karbonil-L-tirozil-terc-butoxi-karbonilhidrazidot acetil-kénsav-piridinium-sóval reagáltatjuk, a kapott termékről hidrogenolízissel lehasítjuk a benziloxi-karbonil-csoportot, majd a kapott O-szulfáto-L-tirozil-terc-butoxi-karbonil-hidrazidot fluorenil-metil-oxi-karbonil-L-aszparaginsav- P-terc-butil-észterrel acilezzük. Az acilezést az aktív észteres vagy a diciklohexil-karbodiimides technikával egyaránt végezhetjük. A kapott védett pepiidből egy lépésben, 85% trifluor-ecetsav, 10% víz, 2% tioglikolsav és 3% ditiotreitol elegyben új megoldással végzett kíméletes acidolízissel a (III) általános képletű dipeptid-hidrazidot állítjuk elő, a szulfátészter csoport ilyen körülmények között nem hasad le. A (III) általános képletű dipeptid in situ savaziddá alakítható, amely alkalmas arra, hogy a (IV) általános képletű védett oktapeptidszulfátészter szintézisét a (II) képletű hexapeptid oldalfunkciós csoportjainak védelme nélkül valósítsuk meg. Az oldalláncvédés elmaradása és a lúgérzékeny N-terminális védőcsoport adott esetben a FMOC-védőcsoport alkalmazása azzal az előnnyel jár, hogy nincs szükség acidolitikus hasításra, s ezáltal kivédhető az acidolízis során fellépő számos mellékreakció (szulfátészter-hasadás, Trp tercbutileződése, az indolváz károsodása, a Met-részek mellékreakciói stb.). Ezek a mellékreakciók elsősorban a terc-butil- illetve terc-butil-oxi-karbonilcsoport acidolízise jorán képződő terc-butil-kation reakciókészségével magyarázhatók. A triptofán indol-gyűrűje pl. több helyen (a 2-, 5- és 7-helyzetben) is terc-butileződhet, a metionin kénatomján pedig a kation megkötődésével szulfónium-ionos szerkezet alakul ki, ez homociszteinné bomolhat. Mindezek az átalakulások a molekula biológiai hatásának teljes elvesztését okozzák, ezért rendkívül fontos a végső acidolitikus lépés helyettesítése lúgos hidrolízissel. Ilyenformán a (IV) általános képletű vegyület egyetlen Y védőcsoportja, ami célszerűen FMOC, igen enyhe reakciókörülmények között 5-10 perces piperidines kezeléssel eltávolítható, s ez a reakció semmiféle mellékreakcióval nem jár. A szintézis előnyös kivitelezési módja szerint első lépésben fluorenil-metil-oxi-karbonil-L-tirozinból kloroformos oldatban klór-hangyasav-izobutilészterrel, morfolin jelenlétében, terc-butil-oxikarbonil-hidraziddal előállítjuk az N-fluorenilmetil-oxi-karbonil-O-szulfáto-tirozil-terc-butiloxi-karbonil-hidrazidot, majd trifluor-ecetsavban a terc-butil-oxi-karbonil-csoportot eltávolítva a nyert hidrazidot aziddá alakítjuk, s ezzel acilezzük a (II) képletű hexapeptidet, így a (VI) általános képletű védett heptapeptid-szulfátésztert nyerjük: FMOC-L-Tyr-L-Met-Gly-L-Trp-L-Met-L-Asp-L-Phe—NH2 A következő lépésben a (VI) általános képletű fluorenil-metil-oxi-karbonil védőcsoportját piperidinnel hasítva, a nyert (VII) általános képletű szabad heptapeptid-szulfátésztert L-Tyr-L-Met-Gly-L-Trp-L-Met-L-Asp-L-Phe—NH2 (VII) i so3h fluorenil-metil-oxi-karbonil-L-aszparaginsav-aaziddal acilezve nyerjük a (IV) általános képletű védett oktapeptid-szulfátésztert. A szintézisben szereplő benzil-oxi-karbonil-L- ' tirozil-terc-butil-oxi-karbonil-hidrazid és a fluorenil-metil-oxi-karbonil-L-tirozil-terc-butil-oxikarbonil-hidrazid szulfátészterének előállítása előnyös módon úgy oldható meg, hogy a megfelelő védett aminosav-származékokat alkalmas oldószerben (piridin, acetonitril, dimetil-formamid) acetil-kénsavval szulfatáljuk. Az eljárás nagy előnye a korábban ismert tirozin-szulfátészter képzési reakciókkal szemben az, hogy nem okoz sem szulfonálódást, sem oxidációs vagy egyéb mellékreakciókat, tehát a III általános képletű kiindulási vegyület tisztán állítható elő, s a termékek alkálifémsói könnyen, tisztán izolálhatok. Az eljárás előnyös kivitelezési módja szerint a két legproblematikusabb reakciót (szulfátészterképzés, a védőcsoportok acidolízise) olyan aminosav, illetve dipeptidszármazékokkal végezzük, amelyek nem tartalmazzák az oktapeptid érzékeny aminosavait, így a fentemlített mellékreakciók kiküszöbölhetők. A módszer alkalmazásával a végső védőcsoport eltávolítását követő egyetlen szilikagél-oszlopkromatográfiás tisztítási lépés után az irodalomban eddig leírt módszerekkel összehasonlítva lényegesen jobb termeléssel, tiszta kolecisztokinin-oktapeptid-szulfátészter nyerhető. A fenti módszerrel előállított (I) általános képletű oktapeptid-szulfátészter állatkísérletekben 2- 5 pg/kg dózisban adva, a kolecisztokininre jellemző gasztrointesztinális hatásokat mutatja, izolált epehólyag csíkon mérve 60-80%-kal hatásosabb a Squibb kolecisztokinin-oktapeptid-szulfátészternél. A készítmény a megfelelő központi idegrendszeri aktivitásokkal is rendelkezik és mind diagnosztikus, mind terápiás célokra is alkalmas. A példákban megadott olvadáspont értékek meghatározása Koffler blokkon történt. A vékonyréteg- és oszlopkromatográfiához kovasavgél („Kieselgel 60”) adszorbenst, illetve réteget („Merck DC Fertigplatten, Kieselgel 60F254”), valamint az alábbi oldószerrendszereket használtuk fel: 1. 95 ml etilacetát: 5 ml ( : n-butanol : ecetsav : víz 75 : 10 : 24). 2. 90 ml etilacetát: 10 ml (: n-butanol : ecetsav : víz 75 : 10 : 24). 3. 85 ml etilacetát: 15 ml (: n-butanol : ecetsav : víz 75 : 10 : 24). 4. 70 ml etilacetát: 30 ml ( : n-butanol : ecetsav : víz 75 : 10 : 24). 5. 60 ml etilacetát: 40 ml ( : piridin : ecetsav : viz 20:6:11). 6. 50 ml etilacetát: 50 ml ( : piridin : ecetsav : víz 20:6:11). 7. n-butanol : ecetsav : viz 8 : 5 : 4. 8. n-butanol : ecetsav : víz 4 : 1 : 1. A találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módját az alábbi példák szemléltetik. 5 10 15 20 25 30 ■35 40 45 50 55 60 65 3
