189135. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 9-hidroxi-3-oxo-4,17(20) pregnadién-20-karbonsav előállítására
189 135 2 A találmány tárgya egylépéses eljárás az (I) általános képletű 9-hidroxi-3-oxo-4,17(20)-pregnadién-20-karbonsav előállítására mikrobiológiai úton a Mycobacterium fortuitum törzs mutánsa felhasználásával. A 4 029 549. sz. USA-beli szabadalmi leírás Mycobacterium fortuitum NRRL B—8119 törzzsel végzett 9-hidroxi-3-oxo-4-pregnén-20-karbonsav (9-hidroxi-bisz-norsav) szintézisét igényli. A 4 035 236. sz. USA-beli szabadalmi leírás ugyan- 10 ezen mikrobával végzett 9-hidroxi-4-androsztén-3,17-dion (9-hidroxi-androsztén-dion) előállítását, a 4 214 051. sz. USA-beli szabadalmi leírás pedig 9-hidroxi-3-oxo-4-pregnén-20-karbonsav-metilészter (9-hidroxi-bisz-norsav-metil-észter) előállítását 5 igényli. A 79104 372.2. sz. európai szabadalmi leírás értékes kortikoidok szintézisében intermedier 9-hidroxi-3-oxo-4,12-(20)-pregnadién-20-karbonsav (I) kétlépéses fermentációs szintézisét ismerteti. Az idézett eljárásban először szterolokat Mycobacterium NRRL B-8054 törzzsel fermentálnak, majd a kapott 3-OXO-4,17(20)-pregnadién-20-karbonsavat a 9a-helyzet hidroxilezésére képes valamely mikroorganizmussal inkubálják. 25 A találmány tárgya egylépéses fermentációs eljárás 9-hidroxi-3-oxo-4,17(20)-pregnadién-20- karbonsav (I) előállítására. Az eljárásban a Mycobacterium fortuitum törzs mutánsát, előnyösen a M. fortuitum NRRL B—8119 új mutánsát használ- 30 juk fel. A 4 029 549. sz. USA-beli szabadalmi leirás M. fortuitum NRRL B—8119 előállítását ismerteti. A leírás 1. példája szerint kapott mutánsokból a találmány szerinti módon további mutánsokat állítunk elő. E mutánsokkal, igy pl. a M. fortuitum 35 NRRL B-12433 törzzsel, a találmány szerinti egylépéses fermentációs eljárásban (I) képletű vegyületet állítunk elő. Az (I) képletű vegyület egylépéses fermentációval való előállítása jelentős előnyökkel rendelkezik a 40 kétlépéses eljárással szemben. Szterinek szelektív lebontására és a ferment lében főtermékként 9-hidroxi-3-oxo-4, 7(20)-karbonsav (I) vegyület felhalmozására képes mutánsokat Mycobacterium fortuitum mikroorganizmustörzsek 45 mutációjával kaphatunk. Szterin alatt 19 szénatomos szteroid vázzal rendelkező, a 3-as helyzetben ß-konfiguraciojü hidroxil-csoportot, az 5. és 6. szénatom között kettős kötést és a 17. helyzetben 2-10 szénatomos oldalláncot tartalmazó vegyületet 50 értünk. Az alábbiakban az M. fortuitum NRRL B-12433 törzs példáján keresztül - mutatjuk be közelebbről az egylépéses fermentációban használt új mutánsok előállítását. 55 Szterineket főtermékként 9-hidroxi-3-oxo- 4,17(20)-pregnadén-20-karbonsav (I) képletű vegyületté alakitó mutáns előállítása Mycobacterium fortuitum NRRLB-8119 törzset 31 *C-on literenként 8 g peptonos húslevest 60 [összetétele : 3 g/1 marhahúskivonat + 5 g/1 pepton ; előállító Difco (Detroit, USA)], 1 g élesztő kivona- - tot, 5 g glicerint, 0,1 % (s/tf) Tween 80-at és desztillált vizet tartalmazó tápkőzegben tenyésztünk. A tápközeget autoklávban 10sPa nyomáson. 20 65 percig stferilezzük. A sejteket kb. 5 x 10* sejt/ml sejtsűrűségig tenyésztjük, majd 0,2 mikron pórusátmérőjű steril szűrőn elkülönítjük és azonos térfogatú 0,1% Tween 80-at tartalmazó 0,1 mólos nátrium-citrat oldattal (melynek pH-ja 5,6) mossuk, majd V4 térfogatrésznyi ugyanilyen pufferben szuszpendáljuk. Ezt követően a szuszpenzióhoz 100 pg/ ml koncentráció eléréséig N-metil-N'-nitro-N- nitrozoguanidint adunk, és 1 órán át 31 *C-on inkubáljuk. A sejteket kétszeres térfogatú, 0,1 % Tween 80-at tartalmazó 0,1 mólos kálium-foszfát pufferrel (melynek pH-ja 7) mossuk, és azonos térfogatú ugyanilyen pufferben szuszpendáljuk. Literenként 8 g peptonos húslevest, 5 g NaCl-t, 5 g glicerint, desztillált vizet és 15 g agart tartalmazó tápközeget 10* Pa nyomáson 20 percig sterilezünk, majd Petri csészékbe öntünk. A mutálandó sejteket e táptalajon tenyésztjük, és a tenyésztés során kapott telepeket kisléptékű fermentációban, szterinekből (I) képletű vegyület előállítására való képességük szempontjából megvizsgáljuk. A kívánt vegyületet a fermentlé metilénkloridos extraktumának vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatával mutatjuk ki, szilikagélen metilén-klorid-aceton-ecetsav (212 : 38 :1) oldószerrendszerrel. Ily módon az NRRL B-12433 mutánst különítjük el, amely a szterinekből főtermékként 9-hidroxi-3-oxo- 4,17(20)-pregnadién-20-karbonsavat [(I) képletű vegyület] halmoz fel. A találmány szerinti mutáns elkülönítésének lényege tehát abban áll, hogy egy olyan mutánsból indulunk ki, amely a szteroid-váz lebontását gátolja (pl. NRRL-B-8119-ből) és 9a-hidroxi-androsztén-diont állít elő, majd további mutációval a szterin oldallánc lebontását biztosítjuk. A találmány szerinti mutáns a kiindulási törzstől - pl. Mycobacterium fortuitum NRL B-8119-től csak a szteroid molekulákra kifejtett hatás tekintetében különbözik. Valamennyi egyéb vonatkozásban, például morfológia és gyógyszerérzékenyséjg szempontjából, hasonló - ha nem azonos - tulajdonságnak. Mindkét M. fortuitum kultúra saválló, mozgásra, spóraképzésre képtelen és az Actinomycetalok rendjének Mycobacterium családjához tartozik. Runyon beosztása szerint (Runyon, E. H., 1959 Med. Clin. North America 43, 273) nemkromogén IV típusú baktérium, vagyis alacsony hőmérsékleten, viszonylag egyszerű táptalajon gyorsan képez nem-pigmentált telepeket. Az M. fortuitum NRRLB-8119 és NRRL B-12433 törzseket a Northern Regional Research Laboratory-ban (U. S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, U. S. A.) deponáltuk. Az M. fortuitum NRRL B-8119 törzs, a törzset ismertető fenti egyesült államokbeli szabadalmi leírások közzétételétől hozzáférhető. Az M. fortuitum NRRL B-12433 törzset 1981. május 4-én deponáltuk. E mikroorganizmusok további kultúráit szükség esetén az NRRL deponáló helyről szerezhetjük be. önmagától értetődik, hogy a tenyészet hozzáférhetősége nem jelent jogcímet arra, hogy e találmányt felhasználják olyan szabadalmi jogok megsértésével, amelyeket törvény biztosít a találmány szerinti kultúra alkalmazása alapján. 2
