189127. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az arginin-vazopresszin antidiuretikus és/vagy vazopresszor hatását antagonizáló új oktapeptidszármazékok előállítására
1 .189 127 2 $-(S-Benzilmerkapto-$$-ciklopentametilén-propionil-Tyr( Et)-Phe-Val-Asn-Cys( Bzl)-Pro- Arg (Tos) -G ly-N H 2 1,43 g (0,5 mmól) gyantához kötött, védett aciloktapeptidet ammonolizálunk, és a terméket meleg dimetil-formamiddal kivonatoljuk. A terméket az oldatból vízzel kicsapjuk, majd a nyersterméket dimetil-formamid, etanol és dietil-éter elegyével újra kicsapjuk. Ily módon 0,490 g (hozam a gyanta kiindulási glicin-tartalmára számítva: 66,54%) tiszta cím szerinti terméket kapunk, op.: 211-213 °C. [a]p = -39,8° (c=l, dimetil-formamid); Rf(E) = 0,59, R,(D) = 0,75. Aminosav-analízis: Tyr: 0,99; Phe: 1,01; Val 1,01; Asp: 1,01; Cys(Bzl): 0,99; Pro: 1,02; Arg: 0,98, Gly: 1,00; NH3: 2,07. $-( S-benzilmerkapto)-$,$-ciklopentametiIénpropionit-Tyr( Me)-Phe- Val-Asn-Cys( Bzl)-Pro- D-Arg(Tos )-Gly-NH 2 0,270 g (0,206 mmól), fent leírt módon előállított tercier-butoxi-karbonil-oktapeptid-amidot felöl - dunk 3 ml trifluor-ecetsavban, és az oldatot 20 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Utána hozzáadunk lehűtött dietil-étert, a kivált csapadékot kiszűrjük és ötször 10 ml dietil-éterrel mossuk, majd csökkentett nyomáson, nátrium-hidroxid felett megszárítjuk. Az így kapott anyagot (súlya: 250 mg) feloldjuk 0,8 ml dimetil-formamidban, majd pH = 7-8-ig (mérés nedves pH-papíron) N- metil-morfolint adunk. A semlegesített oldatot 20 percig szobahőmérsékleten keverjük, majd hozzáadjuk 0,135 g (0,37 mmól) ß-(S-benzilmerkapto)ß,ß-ciklopentametil6n-propionsav-p-nitrofenilészter és 57 mg (0,37 mmól) N-hidroxi-benzotriazol-monohidrát 1,0 ml dimetil-formamiddal készült oldatát. A reakcióelegyet éjszakán át szobahőmérsékleten keverjük, a másnap végzett vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat (E-jelü futtatóelegy) azt mutatja, hogy a reakció lejátszódott. Az elegyhez erélyes keverés közben hozzáadunk 80 ml metanolt és 20 ml dietil-étert. A kivált csapadékot kiszűrjük, metanol és dietil-éter 8 : 2 arányú elegyével mossuk és csökkentett nyomáson megszárítjuk. A nyers terméket (súlya: 270 mg) dimetil-formamidból metanollal kicsapva 263 mg (hozam: 75,2%) cím szerinti acil-peptid-amidot kapunk, op.: 220-221°C; [a]p = —25,7° (c= 1, dimetil-formamid); R,4E) = 0,55, RI(D) = 0,83. Aminosav-analízis: Tyr: 0,98; Phe: 1,01; Val: 1,02; Asp: 1,02; Cys(Bzl): 0,97; Pro: 1,03; Arg: 1,0; Gly: 1,00; NH3: 2,06. ß - ( S-Benzilmerkapto-$ ,$-ciklopentametilén-propi onil)-Tyr( Et)-Phe-Val-Asn-Cys( Bzl)-Pro-DArg(Tos)-Gly-NH 2 0,398 g (0,2 mmól) tercier-butoxi-karbonil-oktapeptid-amidról a védőcsoportot a fent leírt módon lehasítjuk, majd 0,232 g (0,6 mmól) ß-(S-benzilmerkapto)-ß,ß-ciklopentametiten-propionsav-pnitro-fenil-észterrel ugyancsak a fent leírt módon kapcsolva 0,361 g (hozam: 81,67%) cím szerinti acil-oktapeptid-amidot kapunk, op.: 222-224 °C; Md = “22,8° (c = 0,5, dimetil-formamid); R,j(E) = 0,5, R(fD) = 0,83. Aminosav-analízis: Tyr: 1,0; Phe: 1,02; Val: 1,03; Asp: 1,02; Cys(Bzl): 0,98; Pro: 1,03; Arg: 0,98; Gly: 1,00; NH3: 2,11. ß-f S-Benzilmerkapto )-§#~ciklopentametilénpropionil-Tyr( Me ) -Phe- Val-Asn-Cys( Bzl )-Pro- Arg(Tos)- Gly-NH 2 0,394 g (0,3 mmól) tercier-butoxi-karbonil-oktapeptid-amidról a védőcsoportot a fent leírt módon lehasítjuk, majd 0,232 g (0,6 mmól) ß-(S-benzilmerkapto)-ß,ß-ciklopentametil6n-propionsav-pnitro-fenil-észterrel ugyancsak a fent leírt módon kapcsolva 0,388 g (hozam: 88,65%) cím szerinti acil-oktapeptid-amidot kapunk, op.: 211-214 °C; [aló = ~39,2° (c=l, dimetil-formamid); R,(E) = 0,47, R,(D) = 0,85. Aminosav-analízis: Tyr: 0,99; Phe: 1,02; Val: 1,03; Asp: 1,01; Cys(Bzl): 0,99; Pro: 1,02; Arg: 0,99; Gly: 1,00; NH3: 2,04. [ l-($-Merkapto~$,$-ciklopentametilén-propionsav), 2-(0-etil)-tirozin, 4-valin J-arginin-vazopresszin 140 mg (0,095 mmól) védett acil-oktapeptidamid 400 ml nátriumon szárított és kétszer desztillált ammóniával készült oldatát az ammónia forráspontján keverjük és beletartunk egy nátriummal töltött vékony üvegcsövet, mindaddig, míg az elegyben 30 másodpercig meg nem marad a világoskék szín. Utána a szín eltüntetésére hozzáadunk 0,4 ml vízmentes ecetsavat, majd az oldószert nitrogénáramban ledesztilláljuk. 5 percnyi állás után a maradékot feloldjuk 50 ml 10%-os, vizes ecetsavoldatban, majd 800 ml vízzel hígítjuk. Az oldatot 2 mólos ammónium-hidroxid-oldattal pH = 6,5-re állítjuk, majd keverés közben, kis részletekben hozzáadunk 16 ml, 0,01 mólos kálium-ferricianidoldatot. A sárgaszínű oldatot további 10 percig keverjük, majd hozzáadunk 10 g nedves súlyú anioncserélő gyantát (Bio-Rad AG-3, klorid-forma), és az elegyet 10 percig keverjük. Utána a gyantát egy 50 g nedves súlyú gyantából készített szűrőágyon át lassan kiszűrjük, és a szűrőágyat 200 ml 0,2%-os, vizes ecetsav-oldattal mossuk. A szürletet és mosófolyadékot egyesítjük és fagyasztva szárítjuk. Az így kapott porszerű anyagot (súlya: 1,63 g) egy 110 x 2,7 cm méretű Sephadex G-15 oszlopon sómentesítjük, az oszlopot 50%-os, vizes ecetsavval eluáljuk, 5 ml/óra sebességgel. Az elutumot frakciókban gyűjtjük, és mérjük a frakciók abszorpcióját 280 nm hullámhossznál. A fő csúcsot tartalmazó frakciókat egyesitjük és fagyasztva szárítjuk. A 28 mg súlyú maradékot egy 100 x 1,5 cm méretű 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
