189110. lajstromszámú szabadalom • Eljárás (amido)N-helyettesített bleomicin származékok előállítására
1 189 110 2 J 3. táblázat folytatása Vegyület száma Rövidítése Rézmentes forma bak tériumellenes hatása 0tg/mg) Rézmentes forma HeLa S3 elleni 50%-os Mycobacterium smegmatis ATCC 607 ellen Bacillus subtilis ellen novekedesgatlo koncentrációja (ug/ml) 10. dDD-OCT 153 13 0,30 11. dMCLPE-MCLPE 650 270 0,30 12. dMCLPE-BPA 31 690 3690 0,40 13. dMCNBZ-BPA 14 730 4755 1,10 3. Tüdö-toxicitás (tüdöfibrózis) egéren A toxicitás meghatározását 15 hetes hím ICR egéren végezzük, csoportonként 9 állatot használunk a vizsgálathoz. A találmány szerinti eljárással előállított vegyületeket 10 egymást követő napon naponta egyszer intraperitoneális injekció formájában adagoljuk az állatoknak, 5mg/kg dózisban. A kezelés befejeztével az állatokat 5 héten át megfigyelés alatt tartjuk, majd leöljük és felboncoljuk, a tüdöfibrózis előfordulásának és mértékének meghatározása céljából. Az értékelést annak alapján végezzük, hogy hány állatnál található tüdőfibró-20 25 zis, és az milyen mértékű. Az eredményeket a 4. táblázatban közöljük. A toxicitás mértékét az alábbi skála szerint határozzuk meg: 0: nincs fibrózis 1: a tüdőalveolusokban váladék gyűlik össze és az alveolaris septumban fibrózis-szerű elváltozás figyelhető meg 2: néhány területen fibrózis látható 4: szóródott fibrózis 6: fibrózis a teljes terület több, mint 2A részén. A 4. táblázatban feltüntetett arányt a bleomicinkomplex-szel összehasonlítva számoltuk ki. 4. táblázat Vegyület Tüdöfibrózis száma előfordulása fibrózisos egerek száma (%-a) mértéke összesített pontszám/összes minta száma(%) arány 1. 2/9 (20) 2/27 (7) 0,07 3. 0/1 (0) 0/3 (0) 0 6. 0/9 (0) 0/27 (0) 0 7. 0/9 (0) 0/27 (0) 0 8. 0/9 (0) 0/27 (0) 0 9. 0/9 (0) 0/27 (0) 0 10. 0/9 (0) 0/27 (0) 0 A fenti eredményekből látható, hogy a találmány szerinti eljárással előállított vegyületek HeLa S3 sejtek ellen erős növekedésgátló hatással rendelkeznek, és antibakteriális hatásuk is kifejezett, ugyan- 50 akkor toxicitásuk alacsony, fenti tulajdonságaik következtében gyógyászati célokra alkalmazhatók. A találmány szerinti eljárást részleteiben - a korlátozás szándéka nélkül - az alábbi kiviteli példa segítségével kívánjuk ismertetni. Példa A) lépés 800 g friss marhamájat 1,6 1 0,05 mól/l-es foszfátpufferoldattal (pH 7,2) homogenizálunk. A homogenizátumot 8000 fordulat/perc-cel 30 percen át centrifugáljuk. A felülúszót cellulóz-membránon 0,05 mól/l-es foszfát-pufferral szemben dializálva 65 nyers enzimoldatot kapunk, 1,51 nyers enzimoldathoz 32,7 g AMPM-bleomicint adunk. A reakcióelegyet 37 °C-on 24 órán át inkubáljuk. A reakcióelegyhez ezután 150 ml 5%-os triklór-ecetsav-oldatot (továbbiakban TCA) adva kicsapjuk a fehérjét. A csapadékot centrifugálással eltávolítjuk, és 5%os TCA-val háromszor mossuk. A felülúszót és a mosófolyadékokat egyesítjük, 4 n nátrium-hidro- 55 xid-oldattal semlegesítjük, majd 5 g (bleomicinhez képest 1,2 ekvivalens) réz-acetáttal réz-keláttá alakítjuk. A réz-kelátos oldatot sómentesítés céljából vizes DiaionR HP-40 adszorpciós gyantával (Mitsubishi Chemical Co.) töltött 7 1-es oszlopra visszük, 60 ahol a kívánt termék adszorbeálódik. A sót 141 desztillált vízzel kimossuk. Az eluálást 0,02 n vizes hidrogén-klorid-oldat és metanol 1 : 4 arányú elegyével végezzük, a 290 nm közelében abszorpciós maximumot mutató frakciókat egyesítjük, DowexR 7
