189110. lajstromszámú szabadalom • Eljárás (amido)N-helyettesített bleomicin származékok előállítására
1 189 110 2 44-gyel (OH-típus, Dow Chemical Co.) semlegesítjük, majd csökkentett nyomáson koncentráljuk. ' A kapott koncentrátumot előzőleg 0,05 mól/l-es ecetsav-nátrium-acetát-pufferrel (pH 4,5) ekvilibrált CM-Sephadex C-25-tel (Na+-típus, Pharmacia Fine Chemicals Co.) töltött 3 1-es oszlopra visszük, ahol a kívánt anyag adszorbeálódik. Az eluálást lineáris koncentrációgradiens módszerrel végezzük, amely szerint a fenti pufféroldat nátriumkoncentrációját folyamatosan adagolt nátriumkloriddal 1,0 mól/l-re növeljük. A 0,6 mól/1 nátrium-koncentráció közelében eluálódó kék frakciókat összegyűjtjük és egyesítjük. Az egyesített frakciókat a fentebb ismertetett módon DiaionR HP-40- nel sómentesítjük, majd liofilizáljuk. 21,7 g réztartalmú formában lévő APMP-dezamido-bleomicint kapunk, amorf, kék por formájában. A hozam 66%. Ultraibolya abszorpciós spektrum: XM1nm (E 1%/1 cm): 241 (127) és 292 (104), vizes oldatban Infravörös abszorpciós spektrum (KBr) 9maxCm~': 3350,1725,1650, 1560, 1460, 1380, 1200, 1140, 1100, 1060, 1020, 990, 880, 770. Az egyéb fizikai-kémiai jellemzők az 5. táblázatban találhatók. 5. táblázat Szintetizált vegyület Réztartalmú forma vékonyrétegkromatográfiás Rfje*1 Réztartalmú forma elektroferetikus Rm-je*2 (alanin Rm-je 1,0) A PMP-dezami-0,28 0,93 do-bleomicin dAPMP-PEP 0,23 U7 dAPMP-OCT 0,37 1,00 *1 Silica Gel 60F 254 SilanizedR (Merck Co.); metanol és 6%-os ammónium-acetát-oldat 60 : 40 tf. arányú elegye. *2 A vicéi SFR (FMC Co.); 27 : 75 : 900 térfogatarányú hangyasav-ecetsav-víz elegy, 800 V, 15 perc. B) lépés 5 g A) lépésben kapott réztartalmú formában lévő APMP-dezamido-bleomicint és 8,3 g (a bleomicinhez viszonyítva 10 mólekvivalens) 3-[(S)-l'fenil-etil-amino]-propil-amin-hidrogén-kloridot (továbbiakban PEP-amin-hidrogén-klorid) 100 m) dimetil-formamidban oldunk. A kapott oldatot 4°C-ra hütjük és keverés közben hozzáadunk 13,4 g (bleomicinhez viszonyítva 30 mólekvivalens) 1-hidroxi-benztriazolt és 3,63 ml N-metil-morfolint, majd ezt követően 6,8 g (a bleomicinhez viszo nyítva 10 mólekvivalens) diciklohexil-karbodiimi - det. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 6 órán át keverjük. A reakcióelegyből 10 térfogat acetonnal kicsapjuk a kívánt terméket. A csapadékot acetonnal alaposan átmossuk, majd desztillált vízben oldjuk. Az oldatot 0,05 mól/I-es ecetsav-nátrium-acetát pufferral (pH 4,5) ekvilibráit CM-Sephadex C-25- tel (Na+-típus, Pharmacia Fine Chemicals Co.) töltött 500 ml-es oszlopon adszorbeáljuk. Az eluálást lineáris koncentrációgradiens módszerrel végezzük, amely szerint a fenti pufferoldathoz folyamatosan nátrium-kloridot adva a nátriumkoncentrációt fokozatosan 1,0 mól/l-re növeljük. A 0,7 mól/1 nátrium-koncentráció közelében eluálódó kék frakciókat összegyűjtjük és egyesítjük. Az egyesitett frakciókat a fentebb ismertetett módszerrel DiaionR HP-40-nel (500 ml) sómentesítjük, majd liofilizáljuk. 3,3 g réztartalmú formában lévő 3-[(N-metil-amino)-propil-amino]-propil-amino(amido)N-{3-[(S)-1 '-fenií-eti1-amino]-propil}-bleomicint (továbbiakban dAPMP-PEP) kapunk, kék amorf por formájában. A hozam 66%. Ultraibolya abszorpciós spektrum kmax nm (E 1%/1 cm): 214 (108), 292 (87), desztillált vízben. Infravörös abszorpciós spektrum (KBr) 9maxcrn~': 3350, 1725, 1645, 1560, 1460, 1380, 1250, 1140, 1100, 1060, 1015, 990, 880, 765, 700. A termék többi fizikai-kémiai jellemzője az 5. táblázatban található. A fenti B) lépésben a PEP-amin-hidrogén-kloridot és N-metil-morfoIint n-oktil-aminnal helyettesítve 3-[(N-metil-amino)-propil]-amino-propilamino-(amido)N-(n-oktil)-bleomicint (továbbiakban dAPMP-OCT) kapunk. Ultraibolya abszorpciós spektrum kmax nm (E 1%/1 cm): 241 (118) és 292 (95), desztillált vízben. Infravörös abszorpciós spektrum (KBr) .9max (cm-1): 3350, 2940, 1720, 1640, 1555, 1460, 1370, 1250, 1115, 1100, 1060, 1010, 995, 930, 880 és 760. A többi fizikai-kémiai jellemző az 5, táblázatban található. A B) lépésben a PEP-amin-hidrogén-kloridot 3- [di(n-butil)-amino]-propil-aminnal vagy N-{3-[N- metil-N-{3-[2-(p-klór-fenil)-etil]-amino}-propil]amino}-propil-aminnal helyettesítve megfelelő APMP-dezamido-bleomicin-származékokat kapunk. C) lépés 1 g B) lépés szerint előállított réztartalmú formában lévő dAPMP-PEP-et 100 ml metanolban oldunk. Az oldathoz 700 mg (bleomicinre számolva kb. 4 ekvivalens) m,p-di(benzil-oxi)-benzaldehidet, majd 46 mg (bleomicinhez viszonyítva kb. 1,3 ekvivalens) ciano-bór-hidridet adunk. A reakcióelegyet 48 órán át 40 °C-on tartjuk. Az elegyet ezután metanollal mosott CM-ToyopearlR 650-nel (Na+típus, Toyo Soda Mfg.) töltött 100 ml-es oszlopra visszük, ahol a kívánt termék adszorbeálódik. Az oszlopot 200 ml metanollal mossuk. Az eluálást lineáris kocentrációgradiens módszerrel végezzük, oly módon, hogy 500 ml 7 : 3 arányú metanol-víz elegyhez folyamatosan 500 ml, 0,2 mól/1 nátriumkloridot tartalmazó 7 : 3 arányú metanol-víz elegyet adunk. A 0,12 mól/1 sókoncentráció közelében eluálódó 130 ml térfogatú kék frakciókat AmberliteR XAD-2-vel töltött 160 ml-es oszlopra vive ad-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
