189110. lajstromszámú szabadalom • Eljárás (amido)N-helyettesített bleomicin származékok előállítására
1 189 110 2 ismert módon - például a 3 929 993 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban foglaltak szerint - rézmentes formává alakíthatjuk. A rézmentesítést például az alábbiak szerint végezhetjük el. A réztartalmú formában lévő anyagot desztillált vízben oldjuk. Az oldatot desztillált vizes AmberliteR XAD-2-vel töltött oszlopra felvive adszorbeáljuk. A gyantát nátrium-kloridot és 5% etilén-diamin-tetraecetsav-dinátriumsót (a továbbiakban EDTA.2Na néven említjük) tartalmazó vizes oldattal mosva a réziont az EDTA.2Na-val eltávolítjuk, míg a rézmentes formában lévő kívánt anyag a gyantán marad. A gyantát nátrium-kloriddal mosva eltávolítjuk az EDTA.2Na-t, majd desztillált vízzel tovább mossuk. Ezután savas kémhatású vizes metanollal - például 0,2 n vizes hidrogénklorid-oldat és metanol 1 :4 arányú elegyével - eluáljuk a gyantát és összegyűjtjük a 290 nm hullámhossz közelében abszorpciós maximumot mutató frakciókat. Az egyesített frakciók pH-ját DowexR 44 ioncserélő gyantával (OH-típus, Dow Chemical Co.) 6,0-ra állítjuk, majd csökkentett nyomáson koncentráljuk és liofilizáljuk. Fehér amorf porként rézmentes (III) általános képletű kívánt terméket kapunk, hidrogén-klorid-sója formájában. Ha a fenti műveletben hidrogén-klorid helyett kénsavat használunk, kénsavsó formájában kapjuk a (III) általános képletű vegyületet. A sav alkalmas megválasztásával tehát bármely kívánt só formájában kinyerhetjük a (III) általános képletű vegyületet. A találmány szerinti eljárás értelmében a fenti módon előállított (III) általános képletű vegyületet egy (IV) általános képletű aldehiddel kondenzáljuk redukáló körülmények között. Redukálószerként a fenti kondenzációs reakcióban például bór-hidrid-vegyületeket - így nátriumciano-bór-hidridet, nátrium-bór-hidridet, lítiumbór-hidridet, kálium-bór-hidridet -, bisz(trifenilfoszfin)-tetrahidro-boráto-rezet stb. használhatunk. Katalitikus redukciót is végezhetünk, például szénhordozós palládiumkatalizátorral. Ha 1 mól (III) általános képletű vegyületre számolva 2 mól vagy kevesebb, előnyösen 1-1,5 mól (IV) általános képletű vegyületet használunk, R2 helyén lényegében hidrogénatomot tartalmazó (I) általános képletű vegyületet kapunk. 3 mól vagy annál több (IV) általános képletű vegyületet alkalmazva olyan (I) általános képletű vegyületet kapunk, amelynek képletében R2 jelentése —CH2R, csoport. Az R2 helyén hidrogénatomot tartalmazó (I) általános képletű vegyületeket előnyösen 1,2 mól, az R2 helyén —CH2R, csoportot tartalmazó (I) általános képletű vegyületeket pedig 5-15 mól, előnyösen 10 mól (IV) általános képletű aldehidszármazékot használva állítjuk elő. Ha (IV) általános képletű aldehidként egy metanolban rosszul oldódó vegyületet - például m,p-di(benzil-oxi)-benzaldehidet - használunk, a vegyület mennyiségét csökkenthetjük, de ebben az esetben hosszabb reakcióidőt kell alkalmaznunk. A fenti kondenzációs reakcióban használt oldószert illetően nincs különösebb korlátozás, bármely, a reakció szempontjából inert oldószer használható. Oldószerként poláros oldószert - például vizet, metanolt, etanolt, dimetil-formamidot, dimetil-szulfoxidot, tetrahidrofuránt, acetonitrilt, a fenti oldószerek elegyét stb. - használhatunk. A reakcióhőmérséklet — 5 és 80 °C között változhat, rendszerint 0 és 50 °C között lehet. Közelebbről, célszerűen 0 és 25 °C közötti hőmérsékleten dolgozunk az R2 helyén hidrogénatomot tartalmazó (I) általános képletű vegyületek előállításakor, míg az R2 helyén —CH2Rj csoportot tartalmazó (I) általános képletű vegyületeket előnyösen 35 és 50 °C közötti hőmérsékleten állítjuk elő, ha nagy sztérikus gátlású vagy rosszul oldódó aldehidet használunk. A reakcióidő 3-70 óra. Nagy sztérikus gátlású vagy roszszul oldódó aldehid esetén hosszabb reakcióidő - például 150 óra - alkalmazása célszerű. A kapott reakcióelegyből az alábbiak szerint izoláljuk az (I) általános képletű vegyületeket. Ha redukálószerként bór-hidrid-származékot használtunk, a reakcióelegy pH-ját hidrogénkloriddal 1-re állítjuk, majd az elegyet szobahőmérsékleten 5-10 percen át keverve elbontjuk a redukálószer feleslegét. Ezután az elegyet semlegesítjük, csökkentett nyomáson ledesztilláljuk a metanolt, éteres vagy butanolos extrakcióval eltávolítjuk a feleslegben lévő aldehidet és ketont, majd a következőképpen sómentesítjük. A reakcióelegyet adszorpciós gyantával, például desztillált vizes AmberliteR XAD-2-vel (Rohm and Haas Co.) töltött oszlopra vive adszorbeáljuk a kívánt terméket. A sókat desztillált vízzel kimossuk, majd a terméket savas kémhatású vizes metanollal - például 0,02 n vizes hidrogén-klorid-oldat és metanol 1 : 4 térfogatarányú elegyével eluáljuk. A bleomicínszármazékot tartalmazó kék frakciókat egyesítjük, kívánt esetben anioncserélő gyantás kezeléssel, például Dowex 44-gyel (OH-típus, Dow Chemical Co.) semlegesítjük, csökkentett nyomáson koncentráljuk és liofilizáljuk. A kívánt terméket kék por formájában kapjuk. A további tisztítást az alábbiak szerint végezzük. A fentebb kapott port desztillált vízben oldjuk. Az oldatot 0,05 mól/l-es ecetsav-nátrium-acetát pufferrel (pH 4,5) ekvilibrált CM-SephadexR C-25 (Na+-típus, Pharmacia Fine Chemicals Co.) oszlopra vive adszorbeáljuk az anyagot. Az eluálást lineáris koncentrációgradiens módszerrel végezzük, oly módon, hogy a fenti pufferoldathoz folyamatosan nátrium-kloridot adunk, mellyel a nátrium-koncentrációt fokozatosan 1,0 mól/l-re növeljük. Ha azt tapasztaljuk, hogy a kívánt terméket tartalmazó frakciók szennyeződést is tartalmaznak, a fenti kromatográfiás művelet után AmberliteR XAD-2 adszorpciós gyantán kromatografáljuk az anyagot oly módon, hogy a fentebb kapott egyesített frakciókat 4% vizes ammónium-acetátos gyantára visszük. Az eluálást lineáris koncentrációgradiens módszerrel végezzük úgy, hogy a fenti pufferoldathoz folyamatosan metanolt adva fokozatosan növeljük a metanol koncentrációját. Ebben az esetben az átalakulatlan anyagok eluálódnak először, ezt követi az R2 helyén hidrogénatomot tartalmazó (I) általános képletű vegyületek leoldódása, végül azok a vegyületek eluálódnak, amelyek képletében R, és R2 jelentése azonos. A fenti frakciókat az ultraibolya abszorpció köve5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
