189110. lajstromszámú szabadalom • Eljárás (amido)N-helyettesített bleomicin származékok előállítására
1 189 110 2 klór-ecetsawal (TCA) kicsapjuk a proteineket, a csapadékot centrifugálással eltávolítjuk, majd 5%os TCA-val háromszor mossuk, és a felülúszót a mosófolyadékkal egyesítjük. A fehérjementes reakcióelegyet semlegesítjük, majd a bleomicinhez képest feleslegben réz-acetátot adunk az elegyhez, ily módon a kívánt terméket réz-kelát formává alakítjuk. A réz-kelátos oldatot desztillált vizes DiaionR HP-40 adszorpciós gyantával töltött oszlopon sótalanítjuk, a kívánt tennék az oszlopon adszorbeálódik. A sókat desztillált vízzel kimossuk, majd a terméket 0,02 n vizes hidrogén-klorid-oldat és metanol 1 :4 térfogatarányú elegyével eluáljuk, a 290 nm közelében adszorpciós maximumot mutató frakciókat összegyűjtjük. DowexR44 (OH-típus, Dow Chemical Co.) anioncserélő gyantával végzett semlegesítés után az egyesített frakciókat csökkentett nyomáson koncentráljuk és liofilizáljuk. A kapott port desztillált vízben oldjuk. A kapott oldatot CM-SephadexR C-25-tel (Na+-típus, Pharmacia Fine Chemicals Co.) töltött oszlopra viszszük, melyet előzőleg 0,05 mól/l-es ecetsav-nátrium-acetát pufferoldattal (pH 4,5) ekvilibráltunk. Az eluálást lineáris koncentráció-gradiens módszerrel végezzük oly módon, hogy a fenti pufferoldathoz folyamatosan nátrium-kloridot adunk, mellyel a nátrium-koncentrációt fokozatosan 1,0 mól/l-re növeljük. Az UV-adszorpciót mutató frakciókat összegyűjtjük, egyesítjük, és a fentebb leírt módon DiaionR HP-40-nel végzett sómentesítés után liofilizáljuk. Kék amorf por formájában réztartalmú formában lévő APMP-dezamido-bleomicint kapunk. A kapott APMP-dezamido-bleomicint ezután egy (V) általános képletü aminnal önmagában ismert módon kondenzálva kialakítjuk a savamidkötést. A kondenzálást például a 4 195 018 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett eljárással végezzük. A kapott terméket kívánt esetben rézmentesítve (III) általános képletü vegyületet tartalmazó reakcióelegyet kapunk. A fenti kondenzációs reakcióban kondenzálószerként például ciklohexil-karbodiimidet, l-etil-3- (3-dimetil-amino-propil)-karbodiimidet, 1 -ciklohexil-3-(2-morfolino-etil)-karbodiimidet, diizopropilkarbodiimidet, difenil-foszfor-azidátot (DPPA), dietil-foszforo-cianidátot (DEPC), 6-klór-l-(pklór-benzol-szulfonil-oxi)-benztriazolt (CCBT) vagy egyéb hasonló szert használhatunk. A fent említett kondenzálószerek mellett adalékanyagként például p-nitro-fenolt, o,p-dinitrofenolt, pentaklór-fenolt, 2,4,5-triklór-fenolt, pentafluor-fenolt, N-hidroxi-szukcinimidet, N-hidroxi-5-norbornén-2,3-dikarboximidet, 1-hidroxibenztriazolt vagy egyéb hasonló kondenzációs adalékot is használhatunk. A kondenzálást oldószerben - például vízben, dimetil-formamidban, acetonitrilben vagy ezek Hegyében - hajthatjuk végre. A reakcióhőmérséklet - 20 és 50 °C között változhat, előnyösen - 10 és 30 °C között dolgozunk. A reakcióidő nem kritikus, 1-70 óra általában elegendő a reakció lejátszódásához. A (III) általános képletü vegyületet az alábbiak szerint izoláljuk a fenti reakcióelegyből. A reakcióelegyhez szerves oldószert - például acetont, étert vagy egyéb hasonló oldószert - adva kicsapjuk a kívánt terméket. A csapadékot desztillált vízben oldjuk. Az oldat pH-ját 6-ra állítjuk, majd sómentesítés céljából valamely adszorpciós gyantával - például desztillált vizes AmberliteR XAD-2-vel (Rohm and Haas Co.) - töltött oszlopra visszük, ahol a kivánt termék adszorbeálódik. Miután a sókat desztillált vízzel kimostuk, a terméket savas kémhatású vizes metanollal - például 0,02 n vizes hidrogén-klorid-oldat és metanol 1 : 4 arányú elegyével - eluáljuk, és a 290 nm közelében abszorpciós maximumot mutató frakciókat összegyűjtjük. Az egyesített frakciókat anioncserélő gyantás kezeléssel, például DowexR 44-gyel (OH-típus, Dow Chemical Co.) semlegesítve és liofilizálva por formájú (III) általános képletü nyersterméket kapunk. Bizonyos esetekben a fenti sómentesítési lépést elhagyhatjuk. Ekkor a fenti csapadékot desztillált vízben oldjuk, majd a következő lépés szerint kezeljük. A fentebb kapott port desztillált vízben oldjuk. Az oldatot CM-SephadexR C-25-tel (Na+-típus, Pharmacia Fine Chemicals Co.) töltött oszlopra visszük, melyet előzőleg 0,05 mól/l-es ecetsav-nátrium-acetát pufferoldattal (pH 4,5) ekvilibráltunk. Az eluálást lineáris koncentráció-gradiens módszerrel végezzük, oly módon, hogy a fenti pufferoldat nátrium-koncentrációját folyamatos nátriumklorid adagolással fokozatosan 1,0 mól/l-re növeljük. Mivel az átalakulatlan anyagok és melléktermékek hamarabb eluálódnak, mint a kívánt termék, azok az ultraibolya abszorpció folyamatos mérésével elválaszthatók és eltávolíthatók. Ha a kívánt terméket tartalmazó frakciók szennyeződéseket is tartalmaznak, a fenti kromatográfiás eljárást megismételve teljesen eltávolíthatjuk a szenynyeződéseket. A fenti kromatográfiás eljárás helyett adszorpciós gyantát, például AmberliteR XAD-2 gyantát használva is elvégezhetjük a kromatográfiás tisztítást. Ebben az esetben a nyerstermék vizes oldatát például 1%-os vizes ammónium-acetát-oldatban lévő gyantával töltött oszlopra felvive adszorbeáljuk a kívánt terméket. Az eluálást lineáris koncentrációgradiens módszerrel végezzük, amely szerint a fenti pufferoldathoz folyamatosan metanolt adva fokozatosan növeljük a metanol koncentrációját. Mivel ebben az esetben az átalakulatlan anyagok hamarabb, és a melléktermékek később eluálódnak, az ultraibolya abszorpciós folyamatos mérésével elválaszthatjuk azokat a kívánt terméktől. Ha a kívánt terméket tartalmazó frakciók szennyeződéseket is tartalmaznak, a fenti kromatográfiás lépést megismételhetjük a tökéletesebb tisztítás érdekében. A fenti két tisztítási műveletet külön-külön vagy egymással kombinálva is elvégezhetjük. A fenti módon kapott kívánt terméket tartalmazó frakciókat valamely adszorpciós gyantát, például AmberliteR XAD-2-t használva a fentebb ismertetett módon sómentesítjük, majd liofilizáljuk. Kék amorf por formájában réztartalmú formában (III) általános képletü kívánt terméket kapunk. A fenti réztartalmú formát EDTA segítségével 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
