188861. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új lipofil muranil- peptidek előállítására
1 188 86! 2 N - acetil - muramii - L - alanil - D - izoglutamin- 2 - (l’,2’ - dipalmitoil - sn - glicero - 3’ - foszforil) - etil - amid; N - acetil - demetilmuramil - L - alanil - D - izoglu. taminil - 2 - (T,2’ - dipalmitoil - sn - glicero - 3’ - foszforil) - etil - amid és N - acetil - demetilmuramil - L - alanil - D - izoglutaminil - L - alanin - 2 - (3’ - palmitoil - rac - glicero - T - foszforil - etil - amid. b) szubkután alkalmazás esetében: Az „A”, „B”, „C” és „D” jelzésű vegyületet vizsgáltuk. A sejtközvetítö immunitás megnyilvánulása az említett vegyületek útján in vivo ugyancsak fokozható: Míg tengeri malacoknak BSA-val nem teljes Freund-féle adjuvánsban való szenzibilizálása csupán humorális antitestképzéshez vezet, addig a találmány szerinti lipofil muramil-peptideknek 5 - 50 pg dózistartományban való hozzákeverése az antigén olajemulzióhoz később jelentkező túlérzékenységet okoz BSA-val szemben: 3 héttel az immunizálás után BSA-nak bőrbe való befecskendezése ezeknél az állatoknál bőrpirosodással és bőrmegvastagodással járó helyi gyulladásos reakcióhoz vezet, amely 24 — 48 óra alatt maximumot ér el. Ezek a később jelentkező típusú reakciók mennyiségileg és minőségileg megfelelnek azoknak a reakcióknak, amelyeket szokásos módon BSA- val való immunizálás útján teljes Freund-féle adjuvánsban (azaz mikrobaktériumok hozzáadásával) kapunk. Az ED50 értékek nagysága 10 — 20 pg [egy 200 pl nagyságú reakcióvolumen-különbség kiváltásához szükséges mennyiség pg/állat mértékben (bőrpirosodásos felület x bőrmegvastagodás) kezelt és kezeletlen állatoknál, 24 órával a kiváltás után]. A kísérletek során az „A”, „B”, „C”, „D” és „E” jelzésű vegyületeket vizsgáltuk. ! Különösen ki kell emelni ilyen lipofil muramilpeptideknek azt a képességét is, hogy BSA-val együtt liposomákban (tojáslecitin : koleszterin = 4 : 1 ; 4 mg/állat) és a toxikus ásványolajkomponens nélkül való alkalmazásával később jelentkező típusú túlérzékenységet képes előidézni BSA- val szemben. Mennyiségileg és minőségileg ugyancsak azonosak ezek a később jelentkező típusú reakciók azokkal a reakciókkal, amelyeket BSA- val teljes Freund-féle adjuvánsban kapunk. Az ED50-értékek 100-300 pg/állat nagyságúak. A vizsgálat az „A” jelzésű vegyületre terjed ki. Az új (I) általános képletű vegyületek a hidrofil muramilpeptidekkel összehasonlítva további minőségjavulásokat mutatnak. Balb/c egereket 2 x 104 P815 masztocitomsejtekkel a 0. napon immunizálunk. A 15. napon az így immunizált állatok lépsejtjeit in vitro citosztatikus, P815 masztocitomsejtek ellen ható, T-limfociták jelenlétére megvizsgáljuk. Erre a célra a P815 célsejteket 5,Cr-rel jelöljük és a citotoxikus reakció mértékét a radioaktivitás mérésével meghatározzuk a tenyészetben. Az alkalmazott adagban a P815 masztocitomsejtek a befogadó egerekre nézve az immunhatár alatt vannak, azaz nem vagy csak csekély mértékben segítik a citosztatikus T-sejtek képződését. Az „A” jelzésű (I) általános képletű muraruilpeptidek 1 - 50 pg mennyiségben történő egyidejű intraperitoneális alkalmazása a citotoxikus T-sejtek képződésének jelentős növekedéséhez vezet (10 —30-as faktor a kezeletlen egerekkel szemben). Az új (I) általános képletű vegyületek immunitást fokozó tulajdonságai adjuvált autoblasztok által immunizált átültetési antigének elleni fajlagos immuntürés előidézése esetében is kimutathatók egereknél. Valamely kevert limfocitatenyészetben annak az egérnek (C57B1/6J egerek), amelybe a jövőben átültetést végzünk (befogadó), a léplimfocitáit olyan egér (CBA/J egerek) lépsejtjeivel, amelyből a jövőben az átültetés történik (adó vagy donor) együtt inkubáljuk. Olyan fajlagos receptorokkal, amelyek a donor-állat szövetösszeférhetőségéért felelősek, rendelkező T-limfociták burjánzanak és blasztokká alakulnak. Ezek ülepítéssel elválaszthatók más sejtektől. A fajlagos blasztok exprimálják a membránreceptorok fontos idiotipikus sajátosságait és a teljes Freund-féle adjuvánssal (CFA), mint autoimmunogénnel való javítás után a fajlagos tűrés kiváltása céljából az átültetési antigének ellen a prospektiv fogadóállatba (C57 B1/6J) befecskendezzük. Az immunizálást négyszer végezzük négyhetes időközökben autolog anti-CBA/J T-limfoblasztokkal. Az új (I) általános képletű vegyüietekkel adszorbeált T-autoblasztok (109 blaszt 20 mg anyag 20 ml PBS-el készített oldatában szuszpendálva, majd a sejteket két óra hosszat inkubáljuk, ezt követően centrifugáljuk éá PBS-el kétszer mossuk) olyan helyzetben vannak, hogy fajlagos immunösszeférhetőséget létesítenek CFA távollétében, mimellett az adszorbeált anyagok ugyanolyan hatásúak, mint a limfobjasztok a CFA-ban. A vizsgálatot az „A” jelzésű vegyülettel végeztük. Ezen túlmenően az új (1) általános képletű vegyületek 0,5— 100 pg/ml koncentrációkban normális egerek lépsejl-tenyészeteiben képesek antitestképző sejtek kialakulását elősegíteni (19S-pestisképző sejtek 10-30-as faktorral való növekedése a kontrollértékhez képest) stimuláló anyagok távollétében. Ily módon az említett vegyületek távollétében például birkavörösvérsejtek ellen ható fajlagos antitestek képződnek anélkül, hogy a tenyészetekhez birkavörösvérsejteket tettünk volna immunizálás végett. Másrészt az említett anyagok ugyanabban a koncentrációtartományban örökölt thymushiányos nu/nu egereknél a T-sejtekben elszegényedett lépsejttenyészetek immunológiai reaktivitását is képesek növelni valamely normális körülmények között thymustól függő antigénnel szemben (birkavörösvérsejtek) (10-30-as faktor a kezeletlen kontroli-tenyészetekhez viszonyítva). Az említett vegyületek in vitro azonban közvetlenül vagy közvetve nemcsak a B-limfociták (azaz a hatásos antitestképző cellák) szaporító- és szintézisteljesítményét segítik, hanem a T-limfocitákra (amelyekhez a szabályozó aktív segítő- és gátlósejtek, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
