188700. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 1-dezoxinojirimicin N-szubsztituált-származékainak az előállítására
1 188 700 2 A tápoldat komponenseit ásványi anyagoktól mentes vízben okijuk, az oldat pH-értékét 6,5-re állítjuk be. 250 ml tápoldatot 1 1-es Erlenmeyer-lombikba töltünk és 121°C hőmérsékleten 20 percig autoklávban kezeljük. Lehűlés után steril körülmények között hozzáadunk 10 g/1 1-terc-butiloxi-karbonil-amino-szorbitot és a tápoldatot ugyanilyen tápoldatban, azonban az 1— tere—butiloxi—karbonil—amino—szorbit nélkül tenyésztett 5%-os előtenyészettel oltjuk be. Kerek rázógépen 28°C hőmérsékleten 280 ford/perc sebességgel végezzük az inkubálást. 96 óra elteltével elérjük a 10 g/1 teljes átalakulást. A 6-terc-butiloxi-karbonil-amino-szorbóz izolálásának céljából a fermentációs elegyet butanollal extraháljuk, az extraktumot forgó rendszerű bepárló berendezésben bepároljuk és a visszamaradó anyagot etil-acetátból átkristályosítjuk. Olvadáspont: 141— 143°C. ‘ J. példa Az 1- terc-butiloxi-karbonil-amino-szorbit oxidálása Metschnikowia pulcherrima-val (ATTC 20 515). A Metschnikowia pulcherrima mikroroganizmust (ATTC 20 515) ferde agaron olyan táptalajon tenyésztünk, amelynek 1 1-nyi mennyisége 3 g élesztőkivonatot, 6 g peptont, 10 g glükózt, 8 g nátrium-kloridot és 20 g agart tartalmaz ásványi anyagoktól mentes vízben. A kapott előtenyészettel 250 ml folyékony táptalajt ( 1 1-es Erlenmeyer—lombikban) oltunk be, amelynek 1 1-nyi mennyisége 3 g élesztőkivonatot, 6 g peptont, 10 g szorbitot, 8 g nátrium-kloridot és 10 g 1-terc-butiloxi—karbőrül—amino-szorbitot tartalmaz ásványi anyagától mentes vízben, majd a kapott tenyészetet autoklávban 121°C hőmérsékleten 20 percig sterilizáljuk. A tenyészetet ezután 35°C hőmérsékleten kerek rázógépen 200 ford/perc sebességgel inkubáljuk. A tenyésztési folyadékban lévő 1 —tere—butiloxi- karbonil—amino—szorbóz mennyiségét vékonyrétegkromatográfiásan határozzuk meg. 2 nap elteltével 3 g/1 (30%) az átalakulás. A fermentációt ekkor megszakítjuk. 6. példa Az 1 -terc-butiloxi-karbonil -amino-szorbit oxidálása Corynebacterium betae-vel ( DSM 20 141). A Corynebacterium betae mikroorganizmust ( DSM 20 141) ferde agaron tenyésztjük a következő komponenseket tartalmazó táptalajon: 10 g/1 triptikusan emésztett kazein-pepton, 6 g/1 élesztőkivonat, 5 g/1 szorbit, 5 g/1 nátrium klorid és 20 g/1 agar ásványi anyagoktól mentes vízben. Jól átnőtt ferde agarral 250 ml folyékony tápoldatot ( 1 1-es Erlenmeyer-lombikban) oltunk be, amelynek 1 1-nyi mennyisége 10 g triptikusan emésztett kazein-peptont, 5 g élesztőkivonatot, 5 g szorbitot, 5 g nátrium- kloridot és 10 g terc-butiloxi—karbonil—amino -szorbitot tartalmaz. A táptalaj komponenseit ásványi anyagoktól mentes vízben oldjuk és 20 percig 121 °C hőmérsékletű autoklávban történő hevítéssel sterilizáljuk. A tenyészetet 37°C hőmérsékleten kerek rázógépen 200 ford/perc sebességgel inkubáljuk. Az 1- terc-butiloxi-karbonil-amino-szorbóztartalmat vékonyrétegkromatográfiásan határozzuk meg. 2 nap elteltével 5 g/1 (50%) az átalakulás. Ekkor megszakítjuk a fermentációt. 7. példa Az 1 -tere -butiloxi-karbonil-amino-N-metil—szorbit oxidálása Glucobacter oxydans ssp, suboxydans -sál ( DSM 2003). Glucobacter oxydans ssp. suboxydans ( DSM 2003) előtenyészetet tenyésztünk a következő tápoldaton: 200 g/1 szorbit, 40 g/1 élesztőextramtum, 10 g/í kálium—dihidrogén-foszfát ásványi anyagoktól mentes vízben oldva. Előzetesen 20 percig 121°C hőmérsékleten autoklávban kezelt fentiek szerinti 250 ml tápoldatot ferde agar tenyészettel beoltunk és 28°C hőmérsékleten kerek rázógépen 280 ford/perc sebességgel inkubáljuk. 36 óra elteltével az így kapott előtenyészettel 10 1 következő összetételű tápcldalot tartalmazó fermentort oltunk be: 100 g/1 szorbit, 20 g/1 élesztőkivonat, 5 g/1 kálium-dihidrogén-foszfát, 1 ml poliol hab zásgátló, ásványi anyagoktól mentes vízben oldva. A fermentor tartalmát 30 percig sterilizáljuk 121°C hőmérsékleten. A fermentálás körülményei a következők: keverés — 500 ford/ perc, hőmérséklet - 30 °C, levegőztetés -- 10 1 levegő/ perc, a pH—értéket 5 n nátrium—hidroxid—oldat automatikus adagolásával állandó 5,8 értéken tartjuk. 36 óra elteltével 500 ml 20%-os 70 °C hőmérsékletű 1-tcrc-butiloxi-karbonil-amino-N-metil-szorbit—oldatot adagolunk steril körülmények között. 84 óra elteltével elérjük a 10 g/1 teljes átalakulást. Az oxidált terméket a 4. példában leírtakkal azonos módon izoláljuk. 8. példa Az 1 -terc- butiloxi-karbonil amino-N-(/3- —hidroxi—etil)—szorbit oxidálása a Glucobacter oxydans ssp. suboxydans -sál ( DSM 2003). Glucobacter osxdans ssp. suboxydans-t (DSM 2003) a 7. példában leírtakkal azonos módon 10 1-es fermentorban tenyésztünk. 36 óra elteltével 250 ml—t steril körülmények között 1 1-cs Erlenmeyer-lombikba töltünk, amely 2,5 g sterilen bemért 1-terc-butiloxi— —karbonil—amino—N—(j3—hidroxi—etil)—szorbitot tartalmaz. A lombikot 28°C hőmérsékleten 280 ford/perc sebességgel inkubáljuk. 72 óra elteltével elérjük a teljes átalakulást. Az oxidált terméket a 4. példában leírtakkal azonos módon n-butanollal izoláljuk. 9. példa 6-Amino-6 -dezexi—L-szorbóz-hidroklorid előállítása. 20 g N—tere—butiloxi—karbonil-6—amino—6— -dezoxi—L szorbózt keverés és hűtés közben 6,4 ml víz és 13,2 ml tömény sósav-oldat elegyéhez. adunk. A reakcióelegyet 2 órán keresztül hűtés nélkül keverjük, majd 2 óra alatt 120 ml n-propanollal elegyítjük. A kapott kristály—szuszpenziót 1 órán keresztül 0°C hőmérsékleten keverjük és nuccs—szűrőn szűrjük. A kristályos anyagot kevés n propanollal mossuk és szobahőmérsékleten vákuum—szárítószekrényben szárítjuk. Kitermelés: 14,2 gí'92%. Olvadáspont: 116-125°C (bomlás) Elemanalízis a következő összegképletre: C6H13N05 X HC1 (215,2) számított: C 33,30% H 6,54%; N 6,53% kapott: C 33,25% H 6,68% N 6,46% 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
