188681. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mikarozil-tilakton előállítására
1 188 681 táptalajba. A mikarozil-tilakton kinyerését ily módon a tenyészet extrakciójával, vagy a tenyészet szűrését követően a szűrlet és a micélium extrakciójával végezzük. Az extrakciót különböző módszerekkel végezhetjük. Előnyösen úgy járunk el, hogy a szűrt lé tisztítására a levet általában pH-érték beállítása nélkül, megfelelő oldószerrel, például amil-acctáttal vagy petroléterrel extraháljuk, a szerves fázist elkülönítjük, és csökkentett nyomáson desztilláljuk, amikor desztillációs maradékként kristályos anyagot vagy olajos terméket ka- iq punk. A kristályokat vagy az olajos anyagot ezután adszorpciós kromatográfiával tisztítjuk, miután megkapjak a mikarozil-tilaktont és a tilaktont. Az I képletű mikarozil-tilakton enyhén savas rakciókörülmények között hidrolizálható, a hidrolízist kö- 15 vetően megkapjuk a tilaktont. Az enyhén savas hidrolízis reakciókörülményei ismertek. A hidrolízist megfelelő oldatokban végezzük; ezeknek pH-értékét 4-re vagy ennél kisebbre állítjuk be. A reagensek oldatban-tartására poláris, szerves ol- 20 dószert, például alkoholt (például etanolt) kell adagolnunk a reakcióelegyhcz. A hidrolízist 20 ÜC cs 100 °C közötti hőmérsékleten végezzük. A hidrolízishez szükséges reakcióidő a rcakcióelegy pH-jától és a reakció hőmérsékletétől függ. Magasabb pH-értékeken a reak- 25 ció lassúbb, magasabb hőmérsékleten a reakció gyorsabb. A reakciót úgy végezzük, hogy a mikarozil-tilaktont vagy egy 3-0-acil-mikarozil-tilakton-származékot enyhén savas reakcióelcgyben annyi időn át reagáltatjuk, amely elegendő a mikgrozil-csoport hasítására; 30 ily módon tilaktont vagy 3-0-acil-tilaktont kapunk. A tilakton tilozinná vagy tilozinnal rokon vegyületekké alakítható át biológiailag. A biokonverziót úgy végezzük, hogy a tilaktont biokonvertálásra képes mikroorganizmus növekvő tenyészetéhez adjuk. A bio- 35 konvertáló mikroorganizmus lehet maga a tilozint termelő Streptomyces törzs, vagy olyan törzs, amely • képes tilozint termelni, azonban a tilakton-képződés gátolt. Olyan törzset, - amely képes tilozint termelni, de 40 tilakton-bioszintézisének képessége gátolt, oly módon állíthatunk elő, hogy egy tilozint termelő törzset mutagénnel kezelünk, és a túlélőket aszerint vizsgáljuk, képes-e tilozint bioszintetizálni. Azokat" a túlélőket, amelyek tilozint nem termelnek, tovább vizsgáljuk annak" 45 eldöntésére, hogy a törzsek képesek-é (a tilakton bioszintézisére, vagy átalakítják-e a tilaktont tilozinná. Ezeket a törzseket úgy identifikáljuk, hogy rázott tenyészetükhöz tilaktont adagolunk, és meghatározzuk a tilakton tilozinná való átalakulását. 50 A Streptomyces fradiae NRRL 2702 és NRRL 2703 olyan Streptomyces törzsek, amelyek tilozint bioszintetizálnak. A fenti törzsek szelektálásához használható tipikus mutagén szer az N-metil-N’-nitro-N-nitrozó-guanidin. 55 A tilaktont és a 3-0-acil-tilakton-származékokat különösen előnyösen használhatjuk fel bioszintetikus vagy metabolikus vizsgálatokhoz szükséges jelzett vegyületek előállításakor. Bioszintetikus vagy metabolikus vizsgálatokhoz előnyösen használható jelzett tilo- 60 zint kapunk, ha a tilakton részt vagy a cukor-csoportot jelezzük. A 3-0-acil-tilakton-származékok acilcsoportja szintén jelezhető csoportot képvisel. A találmány szerinti eljárást a következőkben példákkal szemléltetjük. 65 1. példa A) mikarozil-tilakton előállítása rázott tenyészetben A Streptomyces fradiae NRRL 12201 fagyasztva szárított tenyészetét 1-2 ml steril vízben szuszpendáljuk. A szuszpenzió 0,5 ml-ével 150 ml, alábbi összetételű vegetatív táptalajt oltunk: összetevő kukoricalekvár élesztőkivonat szójabab dara kalcium-karbonát szójabab olaj (nyers) ionmentes víz Mennyiség (%) 1,0 0,5 0,5 0,3 0,45 97,25 Eljárhatunk oly módon is, hogy a S. fradiae NRRL 12201 egy ml térfogatú, folyékony nitrogénben lefagyasztott és tárolt tenyészetével oltjuk be a vegetatív táptalajt. A beoltott vegetatív táptalajt 500 ml térfogatú Erlenmeycr-lombikokban tenyésztjük, 29 °C hőmérsékleten, 48 órán át, zárt rázógépben, amely percenként 300-at fordul. 0,5 ml inkubált vegetatív tenyészettel 7 ml főfermentációs táptalajt oltunk, aminek összetétele a következő: összetevő répamelasz kukoricaliszt halliszt kukoricadara nátrium-klorid diammónium-hidrogén-foszfát kalcium-karbonát szójabab olaj (nyers) ionmentes víz Mennyiség (%) .2,0 1,0 0,9 0,9 0,1 0,04 0,2 3,0 91,36 A beoltott főfermentációs táptalajt 50 ml térfogatú lombikokban tenyésztjük, 29 °C hőmérsékleten, 6 napon át olyan zárt rázógépben, amely percenként 300-at fordul. B) A mikarozil-tilakton előállítása tankfennentorban Nagy térfogatú inokulum előállítására 60 ml, az A) pontban megadottak szerint előállított vegetatív’tenyészettel 38 1 második fázisú vegetatív táptalajt oltunk. Ennek a táptalajnak az összetétele a következő: összetevő kukoricalekvár szójabab liszt élesztőkivonat kalcium-karbonát szójabab olaj (nyers) lecitin (nyers) víz Mennyiség (%) 1,0 0,5 0,5 0,3 0,5 0,015 97,185 A táptalaj pH-ját 50%-os nátrium-hidroxid-oldattal 8,5-rc állítjuk be. Ezt a második fokozatú vegetatív táptalajt 68 i térfogatú fermentorban inkubáljuk, 47 órán át, 29 °C hőmérsékleten. 3
