188681. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mikarozil-tilakton előállítására
A találmány tárgya eljárás új makrolid antibiotikum előállítására, amelyből előnyös antibiotiukomok, mint például tilozin [lásd Tetrahedron Letters, 2339 (1970)] és tilozin-származekok állíthatók elő. Az új vegyidet az 5-0-mikarozil-20-dihidro-20,23- -didcoxi-tilonolid, mint a továbbiakban az egyszerűség kedvéért mikarozil-tilaktonnak nevezzük. A mikarozil-tilakton szerkezetét az (I) képleten mutatjuk be. Bár a fenti szerkezeti képletben sztereokémiái viszonyokat nem jelöltünk, a vegyüld sztereokémiája azonos a tilozin megfelelő részének sztereokémiájával. Ahogy az a névből kiderül, az (I) képlctű vegyület cukorrésze a mikaróz. A mikarozil-tilaktont intermedierként használjuk fel a tilakton és a tilakton-származékok előállításakor. A mikarozil-tilaktont megkülönböztethetjük a tilaktontól és a tilozin tói szilikagél vékonyréteg-kromatográfiával. Az előhívást kénsavas permcttel vagy tömény, vagy hígított (50%-os) kénsavval végezhetjük. Ezzel az előhívó szerrel a tilakton kezdetben sárga-barna színű foltként, a mikarozil-tilakton pedig kék-bíbor színű foltként jelentkezik. Ha fluoreszcens háttérrel rendelkező szilikagél lemezeket használunk a kromatográfiakor, úgy UV-dctckció lehetséges. A mikarozil-tilakton Rf-értékeit az I. táblázatban adjuk meg. I. Táblázat A mikarozil-tilakton vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálata*1 Vegyület Rf-érték Ab B mikarozil-tilakton 0,17 0,44 tilakton 0,50 0,62 tilozin 0,0 0,0 a = közeg: szilikagél A = benzol és etilb = oldószer-e légy: acetát4:l arányú elegye B = benzol és etil-acetát 3:2 arányú elegye ,A mikarozil-tilakton előállítására a Streptomyces fradiae egy törzsét termeljük süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között, megfelelő öszszetételű táptalajon, mindaddig, amíg jelentős menynyiségű hatóanyag keletkezik. A Streptomyces fradiae tenyésztésére használt táptalaj többféle lehet. A termelés gazdaságossága, a kitermelés optimális volta és a termék izolálásának egyszerűsítése érdekében azonban bizonyos táptalajok előnyösek, így szénfoiráskéut előnyösen a nagyméretű fermentációkor például szénhidrátokat, például dextrint, glükózt, keményítőt, kukoricalisztet és olajokat, mint például szójaolajat használunk. NitrogénforTásként előnyösen kukoricalisztet, szójalisztet, hallisztet, aminosavakat és más, hasonló vegyületet használunk. A táptalaj szervetlen sókat is tartalmazhat, ezek általában olyan sók, amelyek vas-, kálium-, nátrium-, magnézium-, kalcium-, ammonium-, klorid-, karbonát-, szulfát- vagy nitrátionokra, és más hasonló ionokra disszociálnak. A mikroorganizmus növekedéséhez és fejlődéséhez jszenciális nyomelemekre is szükség van; ezeket a táptalajhoz adagoljuk. Általában azonban ezek a nyomelemek a táptalaj többi összetevőjében olyan mennyiségben vannak jelen szennyezőanyagként, hogy a mikroorganizmus növekedési igényét kielégítik. A nagyméretű fermentációkkor habzás esetén kevés (például 0,2 rnl/1) habzásgátlót, például polipropilén-glükolt (molekulasúlya 2000) adagolunk. Nagy mennyiségű mikarozil-tilakton előállítására süllyesztett, levegőztetett fermentációt végzünk tankfermentorban. Kevés mikarozil-tilaktont előállíthatunk rázott tenyészetben is. A nagyméretű fermentorokban levő táptalaj oltásakor megfigyelhető időkiesés, késedelem miatt nem a mikroorganizmus spóráival, hanem előnyösen vegetatív inokulummal oltunk. A vegetatív inokulum előállítására kismennyiségű táptalajt beoltunk a mikroorganizmus spóráival vagy micéliuntaival; ezáltal friss, aktívan növekvő tenyészetet kapunk. A vegetatív inokulummal ezután beoltjuk a főfermentációs táptalajt. A vegetatív inokulum készítésére használt táptalaj azonos lehet a fő fermentációs táptalajjal, használhatunk azonban attól különbözőt is. A találmány szerinti eljárás során használt mikroorganizmust a tilozint termelő Streptomyces fradiae törzs kémiai mutagenezisével kaptuk. A mutagenezissel kapott mikroorganizmus csak minimális mennyiségű tilozint termel, major komponensként mikarozil-tilaktont és tilaktont bioszintetizál. A mikarozil-tilaktont termelő új mikroorganizmust Streptomyces fradiae egy törzsének határoztuk meg. A mikroorganizmus egy tenyészetét letétbe helyeztük a Northern Regional Research Center, Agricultural Research, North Central Region, 1815 North University Street, Peoria, Illinois, 61604 törzsgyűjteményébe, ahonnan az NRRL 12201 számon elkérhető. Ahogy az más mikroorganizmusoknál is megtörténik, a Streptomyces fradiae NRRL 12201 tulajdonságai variálnak. Az irodalomban ismert módszerekkel előállíthatok az NRRL 12201 törzs rekombinánsai, mutánsai vagy variánsai. Mutánsokat kapunk például, ha a sejteket különböző fizikai vagy kémiai mutagénekkel kezeljük, például ultraibolya fénnyel, X-sugarakkal, gamma-sugarakkal vagy N-metil-N’-nitro-N-nitrozó-guanidinnel. A Streptomyces fradiae NRRL 12201 összes természetes és indukált variánsa, mutánsa és rekombinánsa, amelyek megtartották a mikarozil-tilakton termelés képességét, felhasználhatók a jelen szabadalmi leírás szerinti eljárásban. Az S. fradiae NRRL 12201 mikroorganizmus 10 °C és 40 °C közötti hőmérsékleten növekszik. A mikarozil-tilakton optimális termelése 28 °C-on érhető el. Ahogy az a levegőztetett, süllyesztett fermentációkkor szokásos, a táptalajon steril levegőt buborékoltatunk át. A legtöbb antibiotikumot akkor kapjuk, ha a tankfermentáció során a levegő telítettségét 30%-on, vagy ezen felül állítjuk be (28 °C hőmérsékleten és 1 atm nyomáson). A mikarozil-tilakton és a tilakton termelését a fermentáció során a táptalajból vett minták vékonyréteg-kromatográfiás vagy nagyfelbontású folyadék-kromatográfiás vizsgálatával követjük, ultraibolya fénnyel való detekció segítségével. A süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között végzett termelés után a mikarozil-tilaktont a táptalajból ismert módszerekkel különítjük el. A mikarozil-tilakton vízben gyengén oldódik; nem oldódik be a 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
