188667. lajstromszámú szabadalom • Eljárás depolimerizált, szulfatált heparin-poliszacharid elegyek előállítására
1 188 667 rülbelül 70 E/mg antikoaguláns aktivitású (a XVII. amerikai egyesült államok-beli gyógyszerkönyv szerinti módszerrel meghatározva) depolimerizációs termékek állíthatók elő. Ezek a depolimerizációs termékek Sephadex gélen történő frakcionálás útján olyan frakciókra bonthatók, amelyeknek az ült rate ntrifugálás útján meghatározott átlagos molekulasúlyuk 3200-5900 dalton, az amerikai gyógyszerkönyv szerint meghatározott antikoaguláns aktivitásuk pedig 45—95 E/mg. Ezek a depolimerizációs termékek és frakcióik mind orális, mind parenterális úton történő beadás esetén kifejtik aktivitásukat. Ismeretes az is (vö.: Lasker fentebb idézett munkája), hogy a he parin aszkorb insavval és hidrogén-peroxiddal történő depolimerizációja útján kisebb átlagos molekulasúlyú termékek nyerhetők. Az aszkorbinsavval és hidrogén-peroxiddal végzett depolimerizáció termékei, alkoholban történő frakcionálás után olyan frakciókra bonthatók, amelyek átlagos molekulsúlya 4000—7000 dalton, antikoaguláns aktivitása pedig (az idézett amerikai gyógyszerkönyvi módszerrel meghatározva) 12— 100 E/mg. Ismeretes végül (vö.: 2 002 406 A sz. brit szabadalmi bejelentés, közzétéve 1979. 02. 21.) az is, hogy a heparin antikoaguláns aktivitást nem mutató depolimerizációs termékeinek reszulfatizálása útján olyan oligopoliszacharidok állíthatók elő, amelyeknek a Somogy-féle módszerrel meghatározott átlagos molekulasúlyú 2600— 5500 dalton, fajlagos forgatóképessége (vizes oldatban 20 °C-on mérve) +40° — +50°, antikoaguláns aktivitásuk pedig (az idézett amerikai gyógyszerkönyvi módszerrel mérve) kisebb mint 50 E/mg; ezek a termékek mind orális, mind parenterális úton történő beadással hatásosan alkalmazhatók trombózisok megelőzésére. A jelen találmány szerint előállítható poliszacharid-szulfát-származékok olyan szulfátéit poliszacharidok elegyei, amelyek a heparint alkotó poliszachardiokéval egyező általános szerkezetűek, vagyis ugyanolyan elemi' kapcsolatokat mutatnak, mint a heparint alkotó poliszacharidokjés ezek az elemi kötések ugyanolyan módon kapcsolódnak, mint a heparinban. Az (I) általános képletű lánc egyik végén a cukorgyűrűben kettős kötés található. A találmány szerint előállítható poliszacharid-elegyekben a szulfátéit poliszacharidok sav-csoportjai vagy szabad állapotban, vagy nátriumsó alakjában vannak jelen. A találmány szerinti poliszacharid-elegyek nátriumsó alakjában az alábbi jellemző tulajdonságokat mutatják: kéntartalom: 9—13,5 % nitrogéntartalom: 1,8—2,5% uronsavtartalom: 20-30% átlagos molekulasúly: 2000-10 000 dalton fajlagos forgatóképesség vizes oldatban, 20 °C-on: [afp =4-25° -+55°. A fent megadott kén- és nitrogéntartalmat, valamint a fajlagos forgatóképességet a Francia Gyógyszerkönyv 8. kiadás, „Heparin” cikkben megadott módszerekkel határoztuk meg. Az uronsavtartalom meghatározása N. Blumenkrantz és munkatársai [Analytical Biochemistry 54, 484 (1973)] módszere szerint történt. Az átlagos molekulasúlyt gél-permeációs kromatográfiával határoztuk meg poliakrilamid-agaróz gélen, ismert átlagos molekulasúlyú heparinból álló standardra vonatkoztatva, Andresson és munkatársai [Thrombosis Research 9, 575 (1976)] módszere szerint. ' A találmány szerint előállítható poliszacharid-elegyeket alkotó poliszacharidok szerkezetét a csatolt rajz szerinti (I) általános képlet mutatja; e képletben R hidrogénatom vagy karboxiiesoport szabad sav vagy só alakjában, R’ hidroxil- vagy szulfátcsoport, az utóbbi szabad sav vagy só alakjában, Rí hidroxil vagy szulfáicsoport, az utóbbi szabad sav vagy só alakjában, R2 szulfonsav-csoport szabad sav vagy só alakjában, vagy acetilcsoport,-O- oxigén-híd, a -G- csoport pedig a heparin szerkezetében is megjelenő glükozarnin-típusú csoport, míg -U-jelentése uronsav-típusú (D-glükuronsav, L-iduronsav, szulfátéit L-iduronsav), a heparin szerkezetében is megjelenő csoport, n egész szám 3 és 20 között, e határértékeket is beleértve. Az (I) általános képlet szerinti poliszacharidokban a sav csoportok szabad sav vagy só, különösen nátrium-, kalcium- vagy magnéziumsó alakjában lehetnek jelen. Bár a jelen találmány a fenti meghatározásnak megfelelő mindenfajta poliszacharid-elegyek előállítására kiteljed, tárgyát elsősorban, az olyan poliszacharid-elegyek előállítása képezi, amelyek nátriumsó alakjában az alábbi A) táblázat szerinti I., II. és III. kategóriának megfelelő jellemző tulajdonságokat mutatják: 2 A ) táblázat I. II. III. kategória kategória kategória Átlagos molekula-8000-3000-2000-súly (dalton) Antikoaugláns aktivitás in vitro 10 000 8000 7000 (Codex) Anti-Xa aktivitás 130-160 80-140 10-80 in vitro A.P.T.T. aktivitás 130-180 120-250 80-250 in vitro Anti-Xa aktivitás in vitro 100-150 80-120 10-80 A P.T.T. aktivitás in vitro L—1,5 1,4-3 2-10 A fenti táblázatban megadott „Codex” anti-koaguláns aktivitást a Francia Gyógyszerkönyv 8. kiadás, „Heparin” cikkben leírt módszerrel határoztuk meg. Az anti-XA és AP.T.T. aktivitást — mind az A) táblázatban, mind az alábbi B) és C) táblázatban megadott értékek esetében — Teien és munkatársai (fentebb idézett munkája) szerinti módszerrel határoztuk meg, az alább leírt eljárással: a) Az anti-Xa aktivitás meghatározása: Ezt az aktivitást tormbocitáktól mentes ökör-vérplazmán határoztuk meg S 2222 kromogén szubsztrátum [(N-benzoil)-Ile-Glu-Gly-Arg-(p-nitro)-anilid szerkezetű kromogén pepiid] alkalmazásával, a 3. nemzetközi standardhoz viszonyítva. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
