188667. lajstromszámú szabadalom • Eljárás depolimerizált, szulfatált heparin-poliszacharid elegyek előállítására
188 667 53 A vizsgálandó termék,illetőleg a standard 8,4 pH- értékú trisz/etiléndiamin-tetraecetsav vizes pufferoldattal készített 100 fd oldatához, amely 0,02-0,08 Mg mennyiségben tartalmazta a vizsgálandó anyagot illetőleg a standardot, 8,4 pH-értékü vizes trisz/etüéndiamintetraecetsav pufferoldattal 2-5-szörösen hígított citrátos ökör-plazma 100 jul mennyiségét adtuk. Az elegyet 37 °C hőmérsékleten 3 percig inkubáltuk, majd ökörtől származó Xa-faktor vizes oldatának (7 n Kát Xa-faktor) 100 Ml mennyiségét adtuk hozzá. 30 másodperc inkubálás után 200 fd vizes S 2222 oldatot (0,2 Mmól S 2222) adtunk az elegyhez. További 3 perc inkubáció után 300 fd ecetsavat adtunk hozzá és 405 nm-nél mértük az oldat optikai sűrűségét, desztillált vízzel összehasonlítva. Az így nyert optikai sűrűséget a vizsgálandó termék illetőleg a standard koncentrációjával szembeállítva a grafikus ábrázolás két egyenes vonalat mutat, az egyik a vizsgált anyagra, a másik a standardra vonatkozik. A vizsgálandó anyag NE/mg-ban kifejezett aktivitását az alábbi képlet adja meg: a termékre vonatkozó egyenes hajlásszöge a standardra vonatkozó egyenes hajlásszöge a fenti képletben a 173 szám a 3. nemzetközi standard aktivitás-értékének felel meg. b) Az A.P.T.T. aktivitás meghatározása: A vizsgálandó terméket, valamint a 3. nemzetközi standardot 0,15 mólos vizes nátrium-klorid-oldatban oldottuk, majd trombocitáktól mentes citrátos ökör-plazmával hígítottuk olyan arányban, hogy a vizsgálandó anyagnak illetőleg a standardnak a koncentrációja 0 Mg/ml és 4 jug/ml közötti értékeket adjon. 100 fd fenti módon készített oldathoz 100 fd „automated APTT Precibio” reagenst (nyúl-agyvelőből és mikronizált szflícium-dioxidból készített foszfolipidalapú reagens) adtunk. 5 perc inkubálási idő után (37 °C hőmérsékleten) az oldathoz 100 jul 0,025 mólos vizes kalcium-klorid-oldatot adtunk. A megalvadási időt Bio- Mérieux fibrométerrel mértük. A mért megalvadási időket a vizsgálandó tennék illétőleg a standard koncentrációjával grafikusan szembeállítva két egyenes vonalat kaptunk: az egyik a vizsgálandó terméknek, a másik a standardnak felel meg. A vizsgálandó termék NE/mg-ban kifejezett aktivitását az alábbi képlet adja meg: 173. a termékre vonatkozó egyenes hajlásszöge "a standárdra’vonatkózó egyenes hajlásszögé a fenti képletben a 173 szám a 3. nemzetközi standard aktivitás-értékének felel meg. Az A), B) és C) táblázatban megadott valamennyi aktivitás-érték 1 mg-ra vonatkozó nemzetközi egység (NE/mg) értékekben, a 3. nemzetközi standardra vonatkoztatva értendő. A találmány szerinti poliszacharid-elegyeket a heparin karboxilcsoportjainak részleges vagy teljes észterezése útján kapott heparin-észter szervetlen vagy szerves bázissal történő kezelése útján állítjuk elő. Az említett heparinészterben a heparin nem észterezett sav-csoportjai (vagyis a savas szulfát-csoportok és esetleg a karboxil-csoportok egy része is) szabad állapotban vagy só alakjában, különösen alkálifémsó, mint nátriumsó, vagy alkáliföldfémsó, mint kalciumsó vagy magnéziumsó, vagy pedig 1 hosszúláncú kvantemer ammóniumsó, mint benzetóniumsó alakjában lehet jelen. Az olyan esetekben, amikor a heparin-észter vízben oldható (például amikor a nem észterezett sav-csoportok nátriumsó alakjában vannak jelen), az észter és a bázis közötti reakció vízben folytatható le, 20 °C és 80 °C közötti hőmérsékleten; a bázis koncentrációja a közegben előnyösen 0,1 mól/1 és 0,6 mól/1 között lehet. Ehhez a reakcióhoz bázisként vízben oldódó bázisok, így nátrium-hidroxid, kálium-hidroxid, alkálifém-karbonátok, trietilén-amin, trietilén-diamin, kinuklidin, 1,5- -diaza-biciklo[4.3.0]5-nonen vagy 1,5-diaza-biciklo[5.4. 0]5-undecén alkalmazhatók. A reakció befejeztével a depolimerizációs terméket például nátrium-klorid, majd metanol hozzáadásával eszközölt lecsapás útján különíthetjük el a reakcióelegyből. Az észter és a bázis közötti reakciót, különösen olyan esetekben, amikor az észter nem észterezett sav-csoportjai hosszúláncú kvantemer ammóniumsó alakjában vannak jelen, valamely az említett észtert oldani képes inert szerves oldószerben, például diklór-metánbán, dimetilformamidban, formamidban vagy tetrahidrofuránban is lefolytathatjuk, előnyösen 20 °C és 80 °C közötti hőmérsékleten. Bázisként ebben az esetben az alkalmazott oldószerben oldódó bázisok, különösen 1,5-diaza-biciklo [4.3.0]5-nonen, kinuklidin vagy l,5-diaza-biciklo[5,4,0] 5-undecén alkalmazhatók. Á reakció befejeztével a képződött depolimerizációs terméket, amelyben a karboxilcsoportok még mindig észterezett alakban vannak, alkálisó alakjában különítjük el, majd vizes alkálifémhidroxid-oldattal, különösen legalább 1 n koncentrációjú nátrium-hidroxid-oldattal, alacsony (0 °C és +5 °C közötti) hőmérsékleten hidrolizáljuk. A kapott végterméket például nátrium-klorid, majd metanol hozzáadásával eszközölt lecsapás útján különítjük el a reakcíóelegybol. A találmány szerinti eljárásban kiindulási anyagként alkalmazott heparin-észterek nem-szelektív észterek vagy szelektív észterek lehetnek. Nem-szelektív észtereken olyan heparin-észtereket értünk, amelyekben a D-glukuronsav, a nem szulfatált L-iduronsav és a szulfatált L- iduronsav kötések karboxücsoportjai vegyesen vannak észterezve. Szelektív észtereken olyan heparin-észtereket értünk, amelyekben csupán a D-glukuronsav kötések vagy csupán a D-glukuronsav és nem szulfatált L-iduronsav kötések, vagy csupán a nem szulfatált L-iduronsav és szulfatált L-iduronsav kötések, vagy pedig csupán a szulfatált L-iduronsav kötések karboxücsoportjai vannak részlegesen vagy teljesen észterezve. A találmány szerinti eljárásban kiindulási anyagként különösen olyan heparin-észterek alkalmazhatók, amilyeneket a 2 150 724 sz. francia szabadalmi leírás és az 1 501 095 sz. nagy-britanniai szabadalmi leírás ismertetnek, továbbá alkalmazhatók a heparin metil-, etU-, etoxikarbonü-metil-, cianometü-, benzü- és szubsztituált benzü- (különösen 4-klór-benzü- és 4-nitro-benzü-) észterei is. Különösen előnyösen a heparin benzü- és szubsztituált benzil-észterei alkalmazhatók kiindulási anyagként a találmány szerinti eljárásban. Ezek a találmány szerinti eljárásban kiindulási anyagként alkalmazható heparinészterek bármüyen eredetű heparinból (ökör-tüdőből, sertés nyálkahártyából, szarvasmarha-belekből stb. származó heparinból) előállíthatók. A heaprin nem-szelektív metü-, etü-, etoxikarbonü-metU-, cianometü-, benzil- és szubsztituált benzüész-2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
