188657. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antikoaguláns hatású mukopoliszacharidok előállítására
1 188 657 2 sav előállításához használt reagensek minőségének és koncentrációjának, továbbá a reakcióhőmérsékletnek, reakcióidőnek és a pH-nak a vonatkozásában úgy megválasztva, hogy a heparin részleges depolimerizálódása menjen végbe és olyan mukopoliszacharid-keverék képződjék, amelynek legtöbb komponense esetén az YW/USP titer-arány nagyobb, mint 2, célszerűen nagyobb, mint 3. előnyösen nagyobb, mint 6, különösen előnyösen nagyobb, mint 10, továbbá a Yin—Wessler aktivitás (vagyis anti-Xa aktivitás) legalább 200 IU/mg és (II) képletu 2,5-anhidro-D-mannóz szerkezetű, redukáló jellegű végcsoportokat tartalmaz. Ezek az említett végcsoportok a salétromossavnak a heparin N-szulfo-glukózamin-egységeire kifejtett hatása eredményeképpen képződnek. Ha a depolimerizáció kívánatos mértékét elértük, akkor az alkohol típusú oldószerekkel kicsapható mukopoliszacharidokat elkülönítjük. ' Előnyös módon az így elkülöníthető mukopoliszacharid-keveréknek értékes biológiai tulajdonságai vannak, közelebbről USP-titeije kisebb, mint a kiindulási hepariné, ugyanakkor Yin-Wessler titerje nagyobb, mint a kiindulási hepariné. Áppen ezért nem szükséges a találmány szerinti eljárással előállított mukopoliszacharid-keveréket körülményes és drága frakcionálási lépésnek alávetni. További előnyként említhetjük, hogy ezen célszerű előállítási módszer következtében gyakorlatilag kvantitatív hozammal különíthető el a mukopoliszacharid-keverék. A találmány szerinti eljárás egy további előnyös foganatosítási módja értelmében a heparin részleges depolimerizálásával kapott mukopoliszacharid-keveréket a végcsoportok stabilitásának növelése céljából olyan kezelésnek vetjük alá, amely lehetővé teszi az aldehidcsoport átalakítását egy stabilabb funkciós csoporttá, így egy sav- vagy alkoholcsoporttá. A találmány szerinti eljárás egy előnyös foganatosítási módja értelmében kiindulási anyagként mintegy 2000 és 50 000 közötti molekalasúlyú heparint használunk. így például kiindulási anyagként használhatunk szokásos gyógyászati minőségű, injektálható heparint vagy pedig olyan nyers heparint, amelyet emlősök, például sertés vagy szarvasmarha szöveteiből vagy szerveiből, mégpedig hasnyálmirigyéből vagy tüdejéből extrakciós műveletek eredményeképpen különíthetünk el (lásd például Duclos, J. P.: „L’Heparine, fabrication, structure, propriétés, analyse”, II. kötet, 27—37. o.; megjelent 1984-ben a Masson párizsi kiadó gondozásában). A nyers heparin tartalmazhat olyan frakciókat is, amelyeket rendszerint egyébként elhajítanak injektálható minőségű és nagyobb specifikus aktivitású heparin előállítása céljából végzett tisztítási eljárás során. A kiindulási heparint tehát salétromossav hatásának tesszük ki, amely a heparin N-szulfo-glükózamin egységeinek szintjén hat és ezeket az egységeket 2,5-anhidro-D-mannóz szerkezetű csoportokká alakítja. A salétromossavat hozzáadjuk a heparinhoz vagy in situ állítjuk elő úgy, hogy a salétromossav valamelyik megfelelő származékához, célszerűen sójához vagy étersójához olyan savat adunk, amely képes kiszorítani a salétromossavat sójából, és ezt a savat olyan mennyiségben adjuk, hogy a reakcióelegy pH-ja 2 és 3 közé álljon be. A találmány szerinti eljárás egy előnyös foganatosítási módja értelmében a salétromossav valamelyik sóját, különösen alkáli- vagy alkáliföldfémsóját hasznosítjuk a salétromossav in situ előállításához. A leginkább előnyös a nátrium-nitrit használata. A salétromossav in situ történő előállítása céljából tehát savként például sósavat adagolunk. A salétromossav és a heparin közötti reagáltatást előnyösen olyan oldószer jelenlétében hajtjuk végre, amelyben a reagensek oldódnak. Ezért reakcióközegként vizes-alkoholos elegyet használunk. A különböző reakcióparaméterek meghatározását kísérleti úton végezzük. Szakember előtt jól ismert, hogy a különböző reakcióparaméterek egymással milyen mértékben összefüggnek, ezért világos, hogy ezek közül az egyiknek a megváltoztatása következeiében egy vagy több további paramétert is megfelelően be kell állítani. A találmány szerinti eljárás gyakorlati megvalósítása során előnyös a reagenseket olyan mennyiségben használni, hogy a reakcióközeg 100 ml-nyi mennyiségére vonatkoztatva a heparin koncentrációja 1—10 g nagyságrendű, előnyösen 1,5—5 g, különösen előnyösen 2 g körüli legyen, továbbá hogy a nátrium-nitrit koncentrációja 0,02 mól és Q,1 mól között változzon, előnyösen 0,05 mól körüli legyen. A sósavat elegendő mennyiségben használjuk ahhoz, hogy a reakcióelegy pH-ja 2—3, előnyösen 2,2—2,7 különösen 2,5 legyen. Ha a reagáltatást 0 °C és 10 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 4 °C körüli hőmérsékleten hajtjuk végre, akkor a reakcióidőt elég nagyra választjuk meg ahhoz, hogy a depolimerizálódás a kívánt mértékben menjen végbe. (A depolimerizálódás mértékét az YW- és USP- titeiek folyamatos mérésével követjük.) Tájékoztatás kedvéért megjegyezzük, hogy 4 °C hőmérsékleten dolgozva közel 10 perces inkubációs idő elégségesnek bizonyul. Ezt követően a depolimerizációs műveletet megszakítjuk. E célból előnyösen úgy járunk el, hogy a reakcióelegy pH-értékét növeljük. így például egy bázisnak, például nátrium-hidroxidnak a pH-ja legalább semlegesre vagy enyhén lúgosra történő beállításához szükséges mennyiségben való adagolása biztosítja a depolimerizálási reakció kívánt megszakítását. Ezután elkülönítjük azokat a mukopoliszacharidokat, amelyek egy alkohol-típusú oldószer hatására kicsapódnak. E célból előnyösen vízmentes etanolt használunk, a reakcióközeg térfogatára vonatkoztatva közel ötszörös térfogatmennyiségben. Az így kivált csapadékot elkülönítjük, majd hasznosítása céljából mossuk és szárítjuk. A fentiekben ismertetett módon eljárva olyan frakciók különíthetők el, amelyek esetén az YW/USP titerarány 10/1 nagyságrendű és YW/titer 200 IU/mg értéknél nagyobb, és az ilyen frakciókat ráadásul olyan heparinból kapjuk, amelynél az YW/USP titer-arány 1 körüli. Miként említettük, a redukáló jellegű végcsoportok aldehid funkciós csoportja egy stabilabb funkciós csoporttá, például alkohol- vagy karbonsavcsoporttá alakítható, miáltal a mukopoliszacharid láncok végcsoportjainak döntő része 2,5-anhidro-D-mánnitol'vagy 2,5-anhidro-D-mannonsav szerkezetű lesz. A terminális 2,5-anhidro-D-mannóz szerkezetű csoportok 2,5-anhidro-D-mannitol szerkezetű csoportokká való átalakításához az elkülönített, először említett szerkezetű végcsoportot hordozó mukopoliszacharid-3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
