188618. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biológiailag aktív enkefalin-analógok előállítására
1 188618 2 kot feloldjuk 30 ml tetrahidro-furánban. Az oldathoz hozzáadunk 680 mg (3,96 millimól) m-klór-perbenzoesavat és az elegyet 24 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk és a maradékot feloldjuk etil-acetát és víz két- 5 fázisú elegyében. Az elegy pH-ját 2 normál nátriumhidroxid-oldattal 10,0-ra állítjuk, a szerves részt elválasztjuk, vízmentes magnézium-szulfáton megszárítjuk és az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. A maradékként kapott olajat feloldjuk 30 ml trifluor- 10 ecetsav és 3 ml anizol elegyében, az elegyet félórán át 0 °C hőmérsékleten keverjük, majd fagyasztva szárítjuk. Az így kapott szilárd anyagot puffer-oldatban (17 % acetonitrilt tartalmazó, 0,1 mólos ammónium-acetátoldat, pH = 4,3) 9,0 ml össztérfogatra oldjuk, és az olda- 15 tot felvisszük egy 4X70 cm méretű, Ci8 fordított fázisú szilikagéllel töltött, a fenti puffer-oldattal egyensúlyba hozott oszlopra. Az elutumot 280 nm hullámhossznál spektrofotometriásán vizsgáljuk, a megfelelő frakciókat egyesítjük és fagyasztva szárítjuk. Az így ka- 20 port, fehér színű, szilárd anyagot feloldjuk 10 ml 0,2 mólos ecetsav-oldatban, az oldatot felvisszük egy 2,5 X X 90 cm méretű G-10 Sephadex oszlopra. Az oszlopot 0,2 mólos ecetsav-oldatlal eluáljuk, és az elutum frakcióit 280 nm hullámhossznál spektrofotometriásán vizs- 25 gáljuk. A megfelelő frakciókat egyesítjük és fagyasztva szárítjuk. Ily módon fehér színű, szilárd anyag formájában 486 mg (hozam: 23%) cím szerinti vegyületet kapunk[ajp5 = + 51,57° (c = 0,5, 1 mólos ecetsav). 30 Analízis aC32H49Ns09 képlet alapján (mólsúly: 647,8): számított: C 59,33; H 7,62; N 10,81; talált: C 59,55; H 7,78; NI 1,02. 35 Aminosav-analízis: Alá, 1,00; Gly, 0,99; NH3,0,12. Farmakológiai vizsgálatok Az (I) általános képletű vegyületek fájdalomcsillapító hatását egéren hot-plate (fűtőlapos) módszerrel, valamint a writhing (vonaglási) módszerrel mutatjuk ki. A hotplate módszerben a kísérleti állatot egy függőlegesen 45 álló, plexiüvegből készült hengerbe helyezzük, amelynek alaplapja egy 55 °C hőmérsékletre felmelegített fűtőlap. Egy Harlan ND4 törzsbeli egérnek szubkután injekció formájában beadjuk a vizsgálandó anyag megfelelő mennyiségének valamely vivőanyaggal készült oldatát 50 vagy szuszpenzióját, és az állatot 15 perc múlva ráteszszük a fűtőlapra. Meghatározzuk azt a másodpercekben mért késleltetési időt, amelynek elteltével az egér felugrik a forró felületről. Ha valamely anyagnak fájdalomcsillapító hatása van, akkor ezt beadva hosszabb késlel- 55 tetési időt mérünk, mint azoknál az egereknél, amelyek csak a vivőanyagot kapják. A mérést olyan dózistartományban kell végeznünk, amely dózis még nem zavarja meg az állatok mozgásának koordináltságát, és nem teszi őket mozgásképtelenné. Az alábbi táblázatban megadjuk 00 az ebben a vizsgálatban kapott ED50-értékeket. Az ED50- érték az a dózis, amely a vizsgált egerek 50 %-ánál fájdalomcsillapító hatást vált ki. Egy vegyületet akkor tekintünk fájdalomcsillapító hatásúnak, ha beadása után a késleltetési idő egyenlő vagy nagyobb mint a kontroll 05 állatoknál mért késleltetési idő plusz a standard szórás kétszerese. A fájdalomcsillapító hatás százalékos értékeit probit-értékekké alakítjuk, és az ED50-értékeket a dózishatás adatok regressziós analízise útján számítjuk ki. Minden egyes dózis-hatás görbe megrajzolásához legalább négy mérési pontot kell meghatároznunk, és minden egyes mérési pontot legalább tíz kezelt és tíz kontroll egér felhasználásával kell meghatároznunk. A Writhing (vonaglási) módszerben vonaglási válaszreakciónak tekintjük a hasi izomzat összehúzódását, majd ezt követően a hátsó lábak kinyújtását. A vonaglási válaszreakció kiváltása céljából az állatoknak 0,6%-os koncentrációjú ecetsav-oldatot (10 ml/kg) adunk intraperitoneálisan. A vizsgálathoz 5 db, 20-22 g testsúlyú Cox Standard törzsbeli albínó egeret használunk, amelyeket éjszakán át éheztetünk, majd meghatározzuk a vonaglási válaszreakciót. Minden egeret csak egyszer használunk. A megfigyelési idő 10 perc, és 5 perccel az ecetfav-oldat beadása után kezdődik. A vonaglási válaszreakció gátlásának mértékét a kontrollcsoportban megfigyelt vonaglások számának és a vizsgálandó vegyülettel kezeit állatoknál megfigyelt vonaglások számának összehasonlítása útján, az alábbi képlettel számítjuk ki: Százalékos gátlás = 100-vonagiások száma ^ jqq a kísérleti csoportban vonaglások száma a kontrollcsoportban A kontrollcsoportban a 10-perces megfigyelési időszak alatt átlagosan 225-250 vonaglást lehet megfigyelni. EDso-értéknek tekintjük azt a dózist, amely a vonaglások számát 50%-kal csökkenti, az ED50-értéket „A regressziós egyenes fordított alkalmazása” útján [Brownlee, K. A. Statistical Theory and Methodology in Science and Engineering, (Statisztikai elmélet és módszertan a tudományban és a mérnöki tudományokban), 2. kiadás, New York, John Wiley and Sons (1965)] szán útjuk ki. Az alábbi táblázatban megadjuk az (I) általános képletű vegyületek egéren, hot-plate (fűtőlapos) módszerrel, valamint a writhing (vonaglási) módszerrel kapott ED50- értékeit. Táblázat Példa száma Fájdalomcsillapító hatás egéren Hot-plate writhing módszer módszer EDS0, mg/kg ED50,mg/kg Szubkután Orális 1. 0,04 1,14 50,4 2. 0,04 2,1 88,2 3. 0,09 3,6 53,5 4. 0,05 1,81 ~ 160 5. 0,0025 0,1 5,6 11
