188599. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fizilógiásan hatásos CH-1 jelű anyag előállítására

188 599

2

A találmány tárgya eljárás új, fiziológiásán hatásos CH-1 jelű anyag előállítására.

Mindeddig számos olyan poliszacharid volt ismeretes, amelyeknek vagy interferon-képződést előidéző hatásuk vagy tumor ellenes hatásuk volt; poliszacharid típusú, tumor ellenes szert a gyakorlatban használnak (PSK, Japánban kurestin néven van forgalomban, 52—79016 számú nyilvánosságra hozott japán szabadalmi bejelentés).

Azonban olyan anyag, amelynek tumor ellenes hatása is és biztosan interferon-képződést előidéző hatása is lett volna, idáig nem volt ismeretes.

Azt találtuk, hogy az algacsaládba tartozó zöld egysejtű Chlorella nemhez tartozó Chlorella pyrenoidosa törzsből kivont és izolált anyag mindkét fent leírt tulajdonsággal rendelkezik.

A jelen találmány szerinti új, fiziológiásán hatásos CH-1 jelű anyag (az anyag jelölése a továbbiakban CH-1) olyan savanyú poliszacharid, amelynek mind interferonképződést előidéző, mind tumor ellenes hatása is van.

A CH-1-nek a következő fiziko-kémi^i tulajdonságai vannak:

1) legalább szenet, hidrogént, oxigént és nitrogént tartalmaz és az elem-analízis eredménye a következő:

C: 38,49%, H:6,07%, N:l,39%;

2) molekulasúly: cellofán membránon impermeábilis és ultracentrifugában mért S értéke 6,15, ha az anyag koncentrációja 0,2 %, 0,2 mólos pH = 7,2 foszfát pufferben. A rotor típusa: RA 60HC, fordulatszám 51.200/perc;

3) olvadáspont: 240°C-nál elszíneződik, majd magasabb hőmérsékleten elszenesedik;

4) specifikus forgatóképesség: [a]?,9 = -9,52 (c = 1, H20);

5) UV-spektrum: vég-abszorpció 0,125 %-os vizes oldatban;

6) IR-spektrum (lásd az 1. ábrát) KBr tabletta, abszorpciós sávok 3420, 2930, 1640, 1380, 1125, 1065, 1040, 990, 915, 835 és 800 cm'1 -nél;

7) oldhatóság: oldódik: vízben,

oldhatatlan: általában szerves oldószerben, pl. metanolban;

8) színreakció: pozitív: antron, Molisch és karbazol-kénsav reagenssel, negatív: Folin-Lowry és ninhidrin

reagenssel;

9) jellemzői: savanyú kémhatású, acetát-típusú membrán elcktroforézisnél 0,8 cm-re vándorol a pozitív sarok felé a következő feltételek esetén: 0,1 mólos, pH = 5,0 piridin-ecetsav közeg, 200 v, 4 mA, 20 perc;

10) szin: fehér por;

11) protein: nem mutatható ki (Folin-Lowry színreakcióval vizsgálva);

12) monoszacharidanalízis: ramnóz, arabinóz, glükóz, galaktóz és glükoronsav (az anyagot 7 %-os kénsavval hidroiizáltuk 2 órán át visszafolyatással,

t

s a hidrolizátumot papírkromatográfiával és gázkromatográfiával vizsgáltuk);

13) cukor tartalom: 53 % (glükózra számítva);

14) uítracentrifugás kép: lásd a 3. ábrát.

A CH-1 biológiai tulajdonságait a következőkben ismertetjük.

I. Interferonképződést előidéző hatás

1. A vizsgáló módszer (in vitro)

Fehér japán nyulaf az artéria megnyitásával elvéreztettünk. A lépet eltávolítottuk és tripszinnel kezeltük, s így sejtszuszpenziót készítettünk (2,5* 107 sejt). A lépsejt szuszpenziót a CH-l-el inkubáltuk 25 °C-on 24 óra hosszat, majd centrifugáltuk és a feliilúszóban meghatároztuk az interferon titert.

2. B vizsgáló módszer (in vivo)

Négyhetes ddy egereket oltottunk 100 mg/kg CH-1- gvel intravénásán, majd egyenlő időközönként elvéreztettük az egereket és a szérumok interferon titerét meghatároztuk.

3. Az interferon (IF) titer meghatározás módszere

Az 1F titert 50 %-os plakk-csökkentő módszerrel határoztuk meg, RK13 nyűi vese sejtvonai tenyészetet használtunk és agressziós vírusként a Vesicular stomatitis vírust alkalmaztuk.

4. Eredmények

1) in vitro módszerrel: minta koncentrációja

(jug/ml) 10 1 0,1 0,01

IF titer (egység) 49 34 20 -2) in vivo módszerrel:

elvéreztetés ideje 2 óra múlva 5 óra múlva IF titer (egység) 240 15

Fentiek alapján a találmány szerint előállított vegyületnek interferon-képződést előidéző hatása van.

11. Vírusfertőzést gátló hatás

1. Vizsgáló módszer

ddY egereknek CH-l-et adtunk intravénásait, farokvénába oltva, majd az egereket 2 12 óra múlva Vaccinia vírussal fertőztük intravénásán, a farokvénába oltva. A farok bőrön megjelenő pokkokat a fertőzés utáni 8. napon megszámoltuk.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

2