188599. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fizilógiásan hatásos CH-1 jelű anyag előállítására
1 188 599 2 2. Eredmény Az eredményt az alábbi táblázat szemlélteti. Vírusfertőzést gátló hatás Dózis (mg/kg) Kezelés ideje Átlag pokkszám • (5 egér) kontroll _ 58,7 100 —2 óra 1 25 —2 óra 1,6 100 —6 óra 4 25 —6 óra 26 III. Tumor ellenes hatás 1) A P-388 egér-leukémia elleni hatás 20 CDF1 egereket oltottunk intraperitoneálisan 1 * 102 25 P-388 sejttel, majd 1-15 napon keresztül, naponta kezeltük az egereket CH-l-gyel. Eredmény: 30 Dózis (mg/kg/nap) Átlag túlélési napok (4 egér) Túlélés meghosszabbodás, % kontroll 15 0 50 16,8 8 250 19,5 26 35 40 Az eddig ismert, Chlorella nemhez tartozó organizmusból előállított, tumor ellenes hatású anyagot a Chlorella regulárisból izolálták (52-79016 számú nyilvánosságra hozott japán szabadalmi bejelentés). Ez az anyag 3,6 % proteint tartalmaz, míg a CH-l-ben proteint nem tudtunk kimutatni. Továbbá a fenti, régebben ismert anyag 95 ± 2 % glükózt tartalmazó poliszacharid, amelyben nyomnyi mennyiségű ramnóz és galaktóz van, azaz a poliszacharid fő alkotórésze a glükóz. Ezzel szemben a jelen találmány szerint előállított CH-1 olyan poliszacharid, amely kevés galaktózt, arabinózt, glükózt és glükuronsavat tartalmaz, s fő komponense a ramnóz. A két anyag, cukor tartalmukat tekintve, különbözik egymástól. Ennélfogva a CH-1 új anyagnak tekintendő. A jelen találmány a CH-1 anyag előállítására eljárást ú le, amely a Chlorella pyrenoidosa tenyésztését és a CH-1 sejttenyészetből történő izolálását foglalja magában. A találmány szerinti eljárásban alkalmazott Chlorella a természetben igen elterjedt egysejtű alga. A sejtek közül legelőnyösebb a jelen találmányban alkalmazott Chlorella pyrenoidosa, de felhasználhatók azok a CH-1 termelő chlorella sejtek is, amelyeket ultraibolya- és röntgen-besugárzással vagy mutagén kémiai anyagokkal mesterségesen előidézett mutációval állítottunk elő, továbbá a természetes mutánsok. A Chlorella nemhez tartozó chlorella sejteket, jelen találmány szerint, megfelelő tápoldatban tenyésztjük. Olyan tápoldat használható, amely ecetsavat, széndioxidot, kalcium-, magnézium- és káliumsót, ha szükséges más szénforrásokat, így glükózt, nitrogén forrásokat, így karbamidot és vitaminokat tartalmaz. A tenyésztést rendszerint aszeptikus körülmények közt, zárt tartályban, aerob módon végezzük. Látható fényt, például napfényt vagy fluoreszcens fényt alkalmazunk. A CH-1 sejttenyészetből vagy porlasztva szárított sejtekből forró vízzel extrahálható. Az extrakciót 80- 90 °C-on egy órán át végezzük. Az anyagot úgy csapjuk ki, hogy az extraktumot vagy ennek koncentrátumát vízzel elegyedő szerves oldószerrel kezeljük. Előnyös vízzel elegyedő oldószerek a rövid szénláncú alkoholok, pél-Túlélés meghosszabbodás (%) = _átlagos túlélés napokban (kezeiteknél) . joo 100 átlagos túlélés napokban (kezeletleneknél) 2) Az S-180 szolid tumor elleni hatás ICR egereket oltottunk szubkután 1*10"7 Sarcoma- 180 sejttel a 0 napon, majd folyamatosan, 1-9 napig, naponta egyszer adtunk az egereknek intraperitoneálisan CH-1-et. Adag (mg/kg/nap) Átlag túlélés (nap, 5 egér) Túlélés meghosszabbodás, % _ 42 0 50 50 19 250 61 45 dáitl a metanol és etanok Az alkohol koncentrációja előnyösen 40—80 %. Az így kapott csapadékot centrifugálással gyűjtjük össze, majd vízben oldjuk és féligáteresztő hártyán, például cellofán hurkában, dializáljuk és ezzel a kis molekulasúlyú szennyezéseket eltávolítjuk. A tisztított CH-1 előállítására a dializátumot adszorpcics kromatográfiával és gélszűréssel kezeljük. Például a dializátumot DEAE-cellulóz oszlopra adszorbeáljuk és híg lúgos oldattal eluáljuk. Az eluátumot semlegesítjük, majd CM-cellulóz oszlopon kromatografáljuk, s a hatékony frakciót liofilizáljuk. A liofilizált frakciót vízben feloldjuk, DEAE-Sephacel oszlopra adszorbeáljuk, majd gradiens kroinatografálást végzünk vízzel és 0,01 n sósavban oldott 1 mólos nátrium-kloriddal. A CH-1-et úgy kapjuk meg, hogy a hatékony frakciókat egyesítjük, Sephadex G-75 oszlopon gélszűrést végzünk, s az így kapott anyagot liofilizáljuk. 3
