188475. lajstromszámú szabadalom • Eljárás benzotiopiranopiridinonok előállítására
188 475 2 lat elkészített, 2 millimólos l-noradrenalin-tör/.soldatot használunk. d) Helyettesítő (vizsgált) vegyületek Desztillált vízzel olyan oldatokat készítünk a vizsgált vegyületckből, amelyek koncentrációja húszszorosa az elemzési végső koncentrációnak. e) Teszt leírása 1,3 ml elemzési puffer 0,5 ml membrán készítmény (szuszpenzió) 0,1 ml desztillált víz vagy hatóanyag-oldat 0,1 ml/3H/-prazosin-higitás A tesztelegyet jeges fürdőben állítjuk össze, legutoljára a I3 Hl-prazosin-higítást adagolva. Az elegyet 25°C-on 30 percen át inkubáljuk, majd a kötött ligandumot Whatman GF/C jelzésű üvegszálas szűrőn át vákuum alatt végzett szűréssel különítjük el, és ezután a szűrőt 10—10 ml jéghideg elemzési pufferrel kétszer átöblítjük. A szűrőket ezután 80°C-on szárítjuk, majd 5 ml térfogatban alkalmazott ECONOFLUOR (NEN) szcintillációs folyadékban vetjük alá sugárzásszámlálásnak. Mindegyik tesztet, kontrollt, vakmintát és az alkalmazott négyféle helyettesítő koncentráció mindegyikét háromszoros ismétlésben vizsgáljuk. A B tesztre az IC50 értékeket grafikusan — a dózis logaritmusa, mint egyik paraméter függvényében, a specifikus kötési helyek százalékos gátlását, mint másik paramétert ábrázolva — kapott görbéből állapítjuk meg. C. teszt: Patkányok kortikoidális alfa2 receptor kötő helyeinél /3 H/-dihidroergokriptinnelx történő helyettesítés a) Radioligandum Ilyen komponensként 1 juCi/1 pi aktivitású oldat formájában /9,10(n)-3H/-9,10-dihidro-ergokriptint (az Amersham International cég TRK 555 jelzés alatt szállítja, 17,5 Ci/millimól aktivitású) használunk. Ezt a törzsoldatot 1/6250 arányban az elemzési pufferrel higítjuk és a hígításból 0,1 ml térfogatú adagokat használunk 2 ml-es elemzési térfogatokhoz. Ez annyit jelent, hogy' egy-egy elemzésnél 0,45 nanomól /3H/-dihidroergokriptint — amelynek aktivitása 0,016 pCi elemzésenként — használunk. x Kortikoid membránoknál a /3H/-dihidroergokriptin mind az alfaj, mind az alfa2 receptor kötő helyekhez kötődik az itt ismertetett elemzési körülmények között, a kötések mintegy 80%-a történik az alfa2 receptoroknál. b) Membrán készítmény A B tesztnél ismertetettet használjuk. c) Nem specifikus kötés A B tesztnél ismertetett módon járunk el. d) Helyettesítő (vizsgált) vegyületek A B tesztnél ismertetett módon járunk el. e) Teszt leírása A B tesztnél ismertetett módon járunk el, azzal a különbséggel, hogy a tesztelegyet 25°C-on 45 percen át inkubáljuk sötétben. D. teszt: Patkányok kortikoidális muszkarin-receptor kötő helyeinél /3H/-kinuklidinil-benziláttaI történő helyettesítés a) Radioligandum Ilyen komponensként 1 £íCi/l ,ul aktivitású oldat formájában D,L-/3-3H/-kinuklidinil-benzilátot (az Amersham International cég TRK 506 jelzés alatt szállítja, aktivitása 12 Ci/millimól) használunk. Ezt a törzsoldatot 1/13333 arányban az elemzési pufferrel higítjuk és a 1 hígításból 0.1 ml térfogatú adagokat használunk 2 ml-es elemzési térfogatokhoz. Ez annyit jelent, hogy egy-egy elemzésnél 0,31 nanomól /3H/-kinukIidinil-benziIátot - amelynek aktivitása 0,0075 juCi elemzésenként - használunk. b) Membrán készítmény A B tesztnél ismertetettet használjuk. c) Nem specifikus kötés Nem specifikus kötést hozunk létre úgy, hogy elemzési vakmintákhoz 100 /umól oxotremorin-szeszkvifumarátot adagolunk. Ehhez 2 millimólos desztillált vizes törzsoldatot használunk. d) Helyettesítő (vizsgált) vegyületek A B tesztnél ismertetett módon járunk el. e) Teszt leírása A B tesztnél ismertetett módon járunk el, azzal a különbséggel, hogy a tesztelegyet 25öC-on 60 percen át inkubáljuk. IV. táblázat 1C50 (üM) A példa Teszt: A B sor- receptor: dopamin <*[ száma C D muszkarin 1 6,5 6,6 0,6 32,0 2 >10 >10 3,3 45,7 3 >10 >10 4,3 26,9 4 >10 7,8 2,9 57,5 5 5,2 1,7 1,6 19,5 6 0,68 4,0 0,5 >100 7 5,1 >10 2,2 85,1 8 0,68 0.74 1,0 8,1 11 0,49 1,3 0,15 >100 12 2,8 3,1 0,93 32,4 13 1,0 1,5 0,29 44,7 14 0,08 0,89 0,11 75,8 15 0,06 0,68 0,17 87,1 16 0,02 0,02 0,02 >100 17 0,07 0,31 0,07 39,8 18 0,13 0,40 0,08 15,8 19 0,10 4,6 0,15 >100 20 0,01 2,7 0,23 >100 21 0,78 7,1 1,0 100 22 >10 >10 >10 >100 23 4,2 5,9 3,0 >100 24 0,04 >10 >10 >100 25 0,22 1,23 0,06 43,0 26 0,06 0,69 0,05 50,0 27 0,04 0,68 0,05 57.5 28 0,15 2,82 0,32 >100 29 0,17 2,63 0,15 >100 30 0,18 1,15 0.19 >100 31 0,56 3.40 0,65 74,1 32 0,23 0,17 0,21 46,8 33 >10 >10 >10 >100 34 2,81 3,98 0,39 37,2 35 10 10.0 3,30 71,0 36 0,03 0,19 0,15 44,7 37 0,16 1,59 0,60 11,7 38 0,76 >10 2,19 91,2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
