188462. lajstromszámú szabadalom • Javított eljárás digitális növények hatóanyagtartalmának vékonyréteg denzitometriás úton történő analitikai meghatározására
V , 188 462 módszerrel koromatografálunk. A kifejlesztett vékony réteg-kromatogramot érzékeny fluorimetriás módszerrel előhívjuk. A foltok fluoreszcencia intenzitását vékonyréteg-denzitométerrel felvett denzitogramból meghatározzuk, majd a kapott értékekből 5 számítjuk ki a minta hatóanyag komponenseinek mennyiségét. A találmány javított eljárás Digitalis növények hatóanyagtartalmának analitikai meghatározására a növény kivonatolása, majd a kivonat vékonyréteg-denzitometriás 10 módszerrel történő mérése útján, melyre az jellemző, hogy a finomra őrölt Digitalis növényt, főként a Digitalis levelet legalább 70°C-os, előnyösen 80-95°C-os vízzel összekeverjük, majd a rendszert rövid időre felforraljuk és ehhez lehűtés után vízzel korlátoltan, illetve korlátla- 15 nul elegyedő biner oldószerpárt, előnyösen etilacetát-metanol elegyét adva mindössze egy ízben a hatóanyagokat kivonatoljuk, a kivonatból a szilárd részeket, előnyösen ülepítéssel elválasztjuk, majd az oldat hatóanyagait közvetlenül ebből a kivonatból ismert módon mennyiségi 20 vékonyréteg-kromatográfiás módszerrel elválasztjuk és vékonyréteg-denzitometriás eljárással értékeljük. Ilyen módon a korábbi eljárásokban (pl. P. Horváth: Acta Pharm. Hung.: 52, 133 /1982/) alkalmazott számos művelet elhagyható. Szükségtelenné válik az idő- és mun- 25 kaigényes többszöri extrakció és szűrés alkalmazása. A szűréseket egyszeri ülepítési művelet helyettesíti. Mivel a kromatográfiás elválasztás közvetlenül az ülepítéssel nyert oldatból történik, elmarad a csökkentett nyomáson történő besűrítés is, ami különösen nagy mintasoro- 30 zatok esetén szintén jelentős munkamegtakarítást és időnyereséget eredményez. A kapott extraktum tisztájából mért mikrotérfogatú részt megfelelő vékonyréteg-kromatográfiás lapra csepegtetünk. A vékonyréteg-kromatográfiás rendszert a mérni 35 kívánt hatóanyag és egyéb (esetleg zavaró) komponensek szerint választjuk meg. A vékonyréteg-kromatográfiás lapon a vizsgálati minták foltjai mellett minden esetben összehasonlító standard anyagot is futtatunk belső kalibráció céljára. 40 A kifejlesztett kromatogram előhívására olyan, fluorimetriás módszert használunk, melynek érzékenysége a ng/folt nagyságrendbe esik. A foltok fluoreszcencia intenzitását alkalmas kromatogram-spektrofotométer (pl. OPTON KM-3) segítségével 45 mérjük. A kapott denzitogramok megfelelő csúcsterületeiből a vizsgált komponensek mennyiségeit a vékonyréteg laponként meghatározott kalibrációs adatok figyelembevételével számítjuk ki. A találmány szerinti eljárás egyaránt alkalmas szári- 50 tott vagy frissen szedett növényi minták analízisére, és azt az alábbi példákkal szemléltetjük anélkül, hogy oltalmi igényünket a példákra korlátoznánk. 1. példa Száraz Digitalis lanata levél lanatozid C, lamtozid A és 55 digoxin hatóanyagtartalmának meghatározása 7 különböző szárított, 2%-nál nem nagyobb nedvességtartalmú Digitalis lanata mintát az alábbi módszerrel vizsgáltuk: 0,100 g finomra őrölt, (0,315 mm lyukméretű szitán 60 áteső) Digitalis lanata mintát és 0,05 g magnézium-oxidot 20 ml-es csiszolatos üvegdugós kémcsőbe mérünk. 1,00 ml legalább 90°C-os vizet mérünk hozzá, a szuszpenziót fűtőlapon késedelem nélkül felforraljuk, majd a lehűtött kémcsőbe 5,00 ml etilacetátot és 1,00 ml méta- 65 nőit mérünk. Ezen a módon egyidejűleg nagy sorozat minta készíthető el. A mintákat tartalmazó kémcsöveket rázógépen 50 percig rázatjuk. Egy 10x20 cm-es Alufolien Kieselgel 60 (Merck, Darmstadt) vékonyréteg lapon a lap szélétől 1,5 cm-re kezdve az alsó széltől 2 cm-re 1 cm-enként 18 felviteli pontot jelölünk be ceruzával. A felviteli pontokra a 7 db minta oldat tisztájából dekantálás után 2 párhuzamosban, 4 mm széles csíkokban 1-1 /il térfogatokat csepegtetünk fel. A fennmaradó 4 felviteli helyre 2-2 párhuzamosban 1-1 pl, ill. 2-2 /il „A”, ill. „B" összehasonlító oldatot csepegtetünk fel. Az „A” oldat 100,0 ng//il lanatozid C, 100,0 ng/jul lanatozid A, és 40,0 ng/pl digoxin, míg a „B” oldat 50,0 ng/pl lanatozid C, 50,0 ng/jul lanatozid A, ill. 20,0 ng//ul digoxin standard-et tartalmaz kloroform és metanol 1:1 térfogatarányú elegyében. A lapot normál futtató kádban (Desaga, Heidelberg) diklórmetán-metanol-víz (85:13,5:1,5) térfogatarányú elegyében fejlesztjük ki a teljes 10 cm-es magasságig. A kifejlesztett lapot 3 másodpercre klóramin-T triklórecetsav reagensbe mártjuk. A reagens 0,6 g klóramin-T, 20 ml víz, 20 g triklórecetsav, 80 ml etanol és 80 ml kloroform elegyítésével készül. A lapot fémblokk termosztáttal 30 percig 105°C-on tartjuk. Az előhívott foltok fluoreszcencia intenzitását KM-3 kromatogram-spektrofotométerrel (Opton. Oberkochen) reflexió módban a kifejlesztés irányában pásztázva a 365 nm-es Hg vonalon történő gerjesztéssel mérjük M- 436-os monokromátor szűrővel 8x0,2 mm-es rést alkalmazva. A számítást a denzitogram megfelelő csúcsterületeiből lineáris kalibráció alapján számítógépes adatfeldolgozással végezzük. A Digitalis lanata vizsgálati minták mérési eredményeit az I. táblázat foglalja össze. I. táblázat Szárított Digitalis lanata levelek hatóanyagtartalom mg/g egységben Sorszám Lanatozid C * ** Lanatozid A Digoxin 1 4,63 4,58 2,54 0,28 2 7,18 7,23 5,43 1,05 3 2,35 2,33 1,98 4,54 4 9,14 9,17 6,23 0,35 5 3,58 3,57 1,54 0,17 6 6,34 6,18 1,77 0,55 7 4.23 4.32 2.54 0.17 * A találmány szerinti eljárással meghatározott eredmények ** összehasonlítás céljából eluciós vékonyréteg-kromatográfiás módszerrel, Pötter és Barisch (Pharmazie 27, 315 /1972/) eljárásval meghatározott eredmények. A táblázatból kitűnik, hogy az eluciós vékonyréteg-kromatográfiás módszer és a találmány szerinti lényegesen egyszerűbb és gyorsabb eljárás mérési eredményei hibahatáron belül megegyeznek. A leirt módszerrel szükség szerint további glikozid komponensek is meghatározhatók. A módszer statisztikai megbízhatóságának megállapítására a fenti eljárással egyetlen kiválasztott minta extraktumait vizsgáltuk. 35 extraktumot készítettünk, melyeket 5 db vékonyréteg lapra csepegtettünk fel, laponként 7x2 párhuzamosan. A mérés után kapott 35 eredményből számított középérték az adott mintára 7,35 mg/g, míg a korrigált tapasztalati szórásnak a középérték-3
