188462. lajstromszámú szabadalom • Javított eljárás digitális növények hatóanyagtartalmának vékonyréteg denzitometriás úton történő analitikai meghatározására
1 188 462 2 A találmány tárgya javított eljárás Digitalis növények, főként levelek hatóanyagtartalmának analitikai meghatározására vékonyréteg-denzitometriás úton. A Digitalis növényekből, elsősorban a Digitalis lanata leveléből előállított gyógyszer hatóanyagok sok évtizede és ma is a szívgyógyászat egyik legfontosabb gyógyszercsoportját alkotják. A növények nemesítése, minősítése, a feldolgozási technológia fejlesztése, az üzemellenőrzés és újabban a szövetkultúrák vizsgálata évente sokezer minta analitikai feldolgozását igényli. A mintaszámban megnövekedett igények kielégítésére, digitálisz glikozidok meghatározására az elmúlt években radioimmunoassay (RIA), illetve enzyme immunoassay (EIA) módszereket dolgoztak ki (E.W. Weiler és M. H. Zenk: Phytochemistry 15, 1537 119161). A különböző immunoassay módszerek különösen elterjedtek a vérben történő vizsgálatok céljára, ahol a RIA és EIA módszereken kívül alkalmaznak még fluoreszcencia immunoassay (4,231 750 lajtsromszámú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás), a kemilumineszcencia immunoassay (856, 182 lajstromszámú belga szabadalmi leírás) módszereket is. Az immunoassay módszerek egy mintáról általában egyetlen mennyiségi információt adnak, ami egyetlen hatóanyag mennyiségét vagy egy hatóanyag csoport öszszegét jellemzi több-kevesebb szelektivitással. További hátránya e módszereknek, hogy drága reagenseket igényelnek. A RIA módszerek emellett sugárvédelmi előírások kötelező betartását is megkövetelik. A digitálisz növényi minták analitikájában kiterjedten alkalmazott kromatográfiás módszerek bár az időegység alatt általuk végezhető analízisek számát tekintve elmaradnak az immunoassay módszerektől, az egy-egy mintáról kapott kromatogram egyidejűleg sok komponens mennyiségét jellemzi, szemben az immunoassay módszerek által nyújtott „pontszerű” információval. A kromatográfiás módszerek közül alkalmazzák a nagynyomású folyadék-kromatográfiát (P.H. Cobb: Analyst 101, 768 /1976/). A nagyobb sorozatok elemzésére, a komplikált növényi mátrixban történő mérésre a mennyiségi vékonyréteg-kromatográfia azonban többnyire előnyösebb, mert az elválasztás mindig friss adszorbensen történik és így oszlopeltömődési probléma nem jelentkezik. Digitálisz növényi minták analízisére ma is sikerrel alkalmaznak eluciós vékonyréteg-kromatográfiás módszereket (H. Pötter és H. Bärisch: Pharmazie 27, 315 /1972/; P Horváth: Acta Pharm. Hung.:52, 133 /1982/). E módszerek azonban csak viszonylag nagy anyagmenynyiségek elválasztása esetén kellően pontosak, és ez a követelmény általában gyengébb szelektivitást eredményez. Emellett meglehetősen munkaigényesek; e módszerekkel egy fő 8 óra alatt 5-10 növényi minta lanatozid C vagy egyéb hatóanyagtartalmi meghatározását végzi el. A vékonyréteg-denzitometria alkalmazásával a hatóanyag meghatározási módszer munkaigényessége általában csökken, mivel a foltelució művelete feleslegessé válik. A munkaigényesség csökkenése csak abban az esetben válik jelentőssé - és ezzel az analitikai módszer nagyobb mintasorozatok vizsgálatára is alkalmassá - ha a kromatográfiás elválasztást megelőző munkaigényes előkészítő lépéseket is egyszerűsítik. Az eddig ismert, digitálisz növényi anyagok vizsgálatára kidolgozott vékonyréteg-denzitometriás módszerek egyike sem készül ennek a sorozatvizsgálati igényének a kielégítésére, mint azt a következő két példa is mutatja. P. C. Döller és E. Reinhard (Planta Med. 57, 277 /1979/) Digitalis lanata szövet kultúrákban kardenolidok biotranszformációját vizsgálva vékonyréteg-denzitometriás módszert alkalmaz. A mintaelőkészítésben F. Hammerstein és F. Kaiser (Planta Med. 21, 5 /1972/) eljárását alkalmazták. E módszer szerint egy 500 ml-es lombikba 10 g szárított és megőrölt Digitalis lanata levelet mérnek és ehhez 20 ml vizet adnak, majd a lombikok fermentálás céljából 24 óráig 38°C-on termosztálják. Ezután 200 ml metanol-víz (4:1) elegyet hozzáadva a lombik tartalmát reflux alatt 20 percig főzik. A növényi fázist szűréssel elválasztják, majd kevés metanol-víz (4:1) eleggyel kimossák. A szürlethez 1,5 ml ólom/(lI)/acetát oldatot (73 g 150 ml vízben), 1,5 ml nátrium-szulfátot (100 g Na2SO4.10 HjO 150 ml vízben) és 4,5 ml tömény ammónia oldatot adnak. 5 és fél óra állás után a levált ólom-hidroxid csapadékot leszűrik, 20 ml metanol-víz (4:1) eleggyel mossák. A szürletet egy 500 ml-es választó tölcsérben 2x50 ml petroléterrel kirázva tisztítják, majd az alsó fázist egy másik választó tölcsérben 3x75 ml kloroformmal rázzák ki. Az egyesített kloroformos fázist csökkentett nyomáson bepárolják és a száraz maradékot mért térfogatú oldószerben oldják. így kapnak a kromatografálásra alkalmas törzsoldatot. Ch. B. Lugt és L Noordhoek-Ananias (Planta Med. 25, 267 /1947/) hasonló előkészítési módszert alkalmaztak. 250 mg levélmintát egy lombikban 10 ml 70%-os etanolban 1/2 órán keresztül reflux alatt forralnak. Ezután a lombik tartalmához 8 ml vizet adnak, majd leszűrik üveggyapot szűrőn és a szűrési maradékot 70%-os etanol-viz (10:8) elegyével addig mossák, míg a szürlet teljes súlya 50,0 g lesz. Ezt a szürletet petroléterrel extrahálják (5 ml) és a petroléteres extraktumot eltávolítják. Az etanol-vizes fázishoz 5 g 15%-os ólom(II)-acetát oldatot adnak. Néhány perc múlva a folyadékot hajtogatott szűrőpapíron leszűrik. 40 g szürlethez 4,5 g 10%-os Na2HP04.12 H20 oldatot adnak. Újabb szűrés után 35 g szürletet 2x15 ml kloroformmal, majd 4x15 ml kloroform-etanol (2:1) eleggyel extrahálnak. Az egyesített kloroformos extraktumokat mérőlombikban kloroform-etanol (2:1) eleggyel 100 ml térfogatra egészítik ki. 40 ml extraktumot vízfürdőn 60-80 C-on bepárolnak és ezt 1 ml kloroform-metanol (1:1) elegyben feloldva kapják a primer glikozidok denzitometriás méréséhez felhasznált törzsoldatot. A találmány célkitűzése olyan vékonyréteg-denzitometriás módszer kidolgozása, melynek segítségével évi sokezer digitálisz mintáról adható rövid időn belül kevés munkaidő ráfordítással sokrétű mennyiségi analitikai információ. Kísérleteink során azt találtuk, hogy e célkitűzés teljesíthető a következő feltételek mellett: — A növényi eredetű mintát finoman elporítjuk, majd rövid ideig forró vízzel kezeljük. A minta hatóanyagait enzimgátló komponenst (pl. metanolt) is tartalmazó oldószer eleggyel történő rázatással kivonjuk úgy, hogy az extrakció folyadék/növényi szilárd fázis arányát elegendően nagyra választjuk.- Kísérleteink szerint kellően szelektív fluorodenzitometriás módszer alkalmazása esetén a korábbi módszerekben alkalmazott csapadékos és extrakciós előtisztítás felesleges, ezért a kapott extraktum tisztájából dekantálás után közvetlenül mért térfogatú részt alkalmas vékonyréteg-kromatográfiás lapra csepegtetünk, majd megfelelő vékonyréteg-koromatográfiás 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
