188314. lajstromszámú szabadalom • Eljárás melanoma kezelésére alkalmas készítmények előállítására
1 188314 2 oldatban reagáltatjuk az immunglobulinnal. Ha a reagensek oldódása megköveteli, a reakcióközeg legfeljebb 20 térfogat% szerves oldószert tartalmazhat. A szerves oldószer valamely vízzel elegyedő szerves oldószer, például * egy alkohol, előnyösen terc-butanol lehet. A reakció szobahőmérsékleten megy végbe, a reakcióidő néhány óra — 24 óra lehet, amely eltelte után az alacsony molekulasúlyú termékeket és különösen a reagenseket dialízissel eltávolítjuk. A reakció során több szubsztituenst vihetünk be egy protein molekulába, 1 -5 szubsztituenst, ha a protein az immunglobulin G frakcióba, (IgG), 1-15 szubsztituenst, ha a protein az immunglobulin M frakcióba (IgM) tartozik. A fenti módon kapott proteineket a ricin A-láncával úgy kapcsoljuk össze, hogy a két fehérjét vizes oldatban legfeljebb 30 °C hőmérsékleten reagáltatjuk, a reakcióidő néhány óra — 24 óra lehet. A kapott oldatból dialízissel eltávolítjuk az alacsony molekulasúlyú termékeket, majd a konjugált terméket különböző ismert módszerekkel tisztítjuk. A találmányt a következő kiviteli példákkal kívánjuk megvilágítani. 1. példa Aktivált diszulfidcsoporttal szubsztituált humán antimelanoma antitest (P 97 antigén elleni antitest) és a ricin A-láncának összekapcsolásával kapott konjugált szer előállítása a) Humán antimelanoma antitest (anti P97) előállítása A humán antimelanoma antitestet a [Proc. Nat. Acad. Sei. 77, 2183 (1980)] irodalmi helyen leírt módszer szerint állítjuk elő. Az antitestet PBS pufferoldattal (10 mM foszfát, 140 mM nátrium-klorid, pH = 7,4) szemben dializálva tisztítjuk. b) Ricin A -láncának előállítása A ricin A-láncát a 78 27838. számú francia szabadalmi bejelentésben és a 79 24655. számú pótszabadalmi bejelentésben leírtak szerint állítjuk elő és tisztítjuk. c) Aktivált humán antimelanoma antitest előállítása 0,5 ml 20 mg/ml koncentrációjú terc-butanolos 3-(2- piridil-diszulfanil)-propionsav oldathoz 0,2 ml 60 mg/ml koncentrációjú 1 -etil-3-(3-dimetil-amino-propil)-karbodiiinid oldatot adunk és az elegyet 3 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. 30 pl fenti oldatot 1,66 ml 2,4 mg/ml koncentrációjú PBS pufferoldatos antimelanoma antitest oldathoz adunk. Az elegyet 30 °C-on 20 órán át inkubáljuk. A kapott oldatot 3 napon keresztül folyamatosan dializáljuk 2 1 PBS pufferoldattal szemben 4 °C-on. Ily módon 4 mg aktivált antitestet kapunk, 2,3 mg|ml koncentrációjú PBS pufferoldatos oldatban. 343 nm-en spektrofotometriásán mérve a piridin-2- tion felszabadulását redukált glutauonnal történő kicserélődési reakcióban úgy találtuk, hogy az antitest 2,6 aktivátor csoportot tartalmaz molekulánként. d) Konjugált termék előállítása 1,3 ml PBS pufferoldatos aktivált antitest oldathoz (koncentrációja 2,3 mg/ml vagy 3 mg aktivált antitest) 0,52 ml ricin A-lánc oldatot adunk, (koncentrációja 5,8 m|/ml, oldószerként PBS pufferoldatot használunk), és 25 C-on 20 órán át inkubáljuk az elegyet. A reakcióelegyet Sephadex G 100 oszlopon kromatografáljuk. Az egyes frakciók antitest-tartalmát 280 nm-en spektrofotometriásán mérjük, a ricin A-lánc koncentrációját sejtmentes rendszerben proteinszintézis-gátlás mérésével határozzuk meg. Az azonos, konjugált terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, 0,2 mg/ml koncentrációjú oldatban körülbelül 1 mg konjugált terméket kapunk ily módon. Citofluorimetriás mérések azt mutatják, hogy a használt antimelanoma antitest, a megfelelő aktivált antitest és a ricin A-láncának és az antitestnek összekapcsolásával kapott konjugált szer nagyon hasonló fluoreszcenciás h sztogramot ad, ami azt jelzi, hogy az antitest az aktiválás és a kapcsolási reakció során nem változott meg lényegesen, és főleg, továbbra is képes konjugátum formájában is a P 97 antigént felismerni. A találmány szerinti eljárással kapott konjugátum biológiai sajátságait és különösen rákellenes hatását vizsgáljuk a továbbiakban. 1) Proteinszintézis-gátlás A ricin A-láncának alapvető biológiai tulajdonsága a proteinszintézis gátlása. A gátlás oka a 60 S riboszómaalcgység megváltoztatása. A proteinszintézis gátlásának tanulmányozására sejtmodellt használunk, A vizsgálat során mérjük a vizsgált vegyületek hatását a 14C-leucin beépülésére a rákos sejtekbe, sejtkultúrában. A használt sejtek a P 97 antigént tartalmazó humán melanoma sejtből származó M 1477 sejtvonalhoz tartoznak. [A sejtvonalat a Sloan Kettering Institute-tól (USA) kaptuk.] A sejteket tripszines kezelés után legalább 24 órán át előinkubáljuk, ezalatt az esetlegesen megváltozott felületi antigének regenerálódnak. A vizsgálandó anyagok hozzáadása után a sejteket újra inkubáljuk. Az inkubáció befejeztével mérjük a 14C-leucin beépülésének mértékét a sejtekbe. A mérést a [J. Biol.Chem. 249, 3557 (1974)] irodalmi helyen leírt módszer szerint végezzük, a proteinszintézis mértékét a 14C-leucin beépülésével határozzuk meg. A beépült radioaktivitást a sejtek leszűrése után a teljes sejtben határozzuk meg. A mérések alapján felrajzoljuk a dózis-hatás görbéket. Az x-tengelyen a vizsgált vegyületek koncentrációját (M), az y-tengelyen a 14C-leucin beépülését ábrázoljuk, utóbbit a kontroll (vizsgált vegyület nélküli l4C-leucin beépülés) százalékában adjuk meg. Minden vizsgált vegyületre meghatározzuk az 50 %-os inhibitor-koncentrációt (1C50), vagyis a vizsgált vegyületnek azt a koncentrációját M-ban kifejezve, ami a Jelenein beépülését a felére csökkenti. Az 1. példa szerint előállított konjugátumra (ITHM) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
