188314. lajstromszámú szabadalom • Eljárás melanoma kezelésére alkalmas készítmények előállítására
1 188 314 2 kapott értékek az 1. ábrán láthatók. Ugyanitt tüntetjük fel a ricinre (R), a ricin A-láncára (AR) és a ricin A-láncdinitrofenil gyök (DJsíP) elleni antitest összekapcsolásával nyert DS 10 konjugátumra kapott értékeket is, az utóbbi konjugátum nem mutat semmiféle affinitást a vizsgált sejtekkel szemben. Az 1. ábrából kitűnik, hogy az ITHM konjugátum igen jelentős citotoxikus hatással rendelkezik (IC50 = = 5-10“9 MX ez körülbelül 400-szorosa a ricin A-lánc citotoxicitásának. Továbbá az 1. ábrából látható az is, hogy az anti-DPN és a ricin A-lánc összekapcsolásával nyert DS 10 konjugátum nem hat az M1477 sejtekre, még a legmagasabb vizsgált koncentrációban (10"6 M) sem. Ezzel szemben, a konjugátum citotoxikusnak bizonyul az M 1477 sejtekre (ICso 10"9 M), ha a sejteket előzőleg mesterségesen DNP-gyökökkel kapcsoljuk. Ez a két utóbbi eredmény is alátámasztja az ITHM konjugátum specifikus citotoxicitását. 2) Tekpképzés gátlásának tanulmányozása Az M 1477 melanoma sejteket Versene oldattal (250 mg/1 cti]én-diamin-tetraecetsavat tartalmazó PBS pufferoldat) vagy tripszines kezeléssel elválasztjuk a szilárd hordozófelületről. A sejteket 5 cm átmérőjű Petri-csészébe oltjuk, 2* 104 sejt/Pçtri-csésze koncentrációban. A-Petri-csészében a következő táptalaj van: 2 mM glutaminnat, 2 g/1 nátrium-hidro|én-karbonáttal, 15 % inaktívált magzati marhaszérummal (gyártja a Seromed) és antibiotikumokkal (penicillin, streptomicin és amfotericin B) kiegészített RPMI 1640 (gyártja a Merieux) táptalaj. 24 óra elteltével a sejteket a vizsgálandó konjugátum különböző koncentrációjú oldataival kezeljük. összehasonlításképpen a sejteket ricinnel, ricin A- lánccal, és a sejtekre nem-specifikus konjugátummal (ricin A-lánc és anti-DPN antitest összekapcsolásával előállított DS 10 konjugátum) is kezeljük. Üjabb 24 órás inkubálás után a táptalajt eltávolítjuk és friss táptalajjal helyettesítjük, amely nem tartalmaz vizsgálandó vegyületet. 10-15 napig tartó inkubálás után a képződött telepszámot kristályibolya oldattal végzett festés után automata telepszámláló [Artek 880 rendszer, gyártja a Tynateck (USA)] segítségével meghatározzuk. A módszer érzékenysége 10 élő sejt/Petri-csésze, mint azt kontroll tenyészetek segítségével igazoltuk. Azt is bizonyítottuk, hogy a telepképzés erősen függ a sejtek kiindulási koncentrációjától, legalábbis a 101 —104 sejt/ml koncentrációtartományon belül. Az eredményeket a 2. ábrán tüntetjük fel Az y-tengelyen a Petri-csészénként kapott telepek számát ábrázoljuk, logaritmikus léptékben, a vizsgált vegyületek koncentrációját (M) az x-tengelyen tüntetjük fel. A vizsgált vegyületek: ricin (R), ricin A-lánc (AR), és a találmány 1. példája szerint előállított konjugátum (ITHM). Az ITHM konjugátumnak igen nagy citotoxikus hatása van, mivel 2*10"9 M koncentrációban is elpusztítja az összes melanoma sejtet. Ez a koncentráció összemérhető a ricin 100 % sejtelhalást okozó koncentrációjával (1 • 10"9 M), míg a ricin A-láncából 10"6 M kell azonos hatás eléréséhez. Itt kell megjegyeznünk, hogy a DS 10 konjugátum a vizsgált legmagasabb koncentrációban (2* 10"8 M) sem mutatott citotoxikus hatást. A kísérlet eredményei megerősítik a proteinszintézis gátlására vonatkozó kísérlet eredményeit. A találmány szerinti eljárással előállított konjugátum jelentős specificitással bír a humán melanoma sejtvonallal szemben. Ezért humán gyógyászatban alkalmazható a melanoma kezelésére, és feltehetően más olyan rákos vagy nem rákos daganatok kezelésére is, amelyek érzékenyek a konjugátumban levő antitestre. A konjugátumok injektálásra alkalmas gyógyszerkészítmény formájában állíthatók elő. Alkalmazhatók egymagukban vagy más rákellenes vagy egyéb szerekkel együtt, különösen olyan immundepresszív anyagokkal együtt adva hatásosak, amelyek csökkentik a kezelt személyek természetes immunreakcióit a szervezetük számára idegen fehérjét jelentő konjugátummal szemben. Mivel a kezelés célja az összes rákos sejt elpusztítása, a kezelést megfelelő mennyiségű konjugátummal kell végezni, és a kezelés során minden egyes esetben meg kell határozni a kezelendő alany állapotát és a kezelendő elváltozások természetét. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás melanoma tumorok kezelésére alkalmas, a ricin A-láncához kapcsolt humán antimelanoma antitestet tartalmazó konjugátumok előállítására, azzal jellemezve, hogy az RA-SH képletű ricin A-láncot egy AC-R-S-S-X képletű antimelanoma antitest-származékkal — a képletben AC jelentése antimelanoma-antitest, X jelentése aktivátor gyök, és R jelentése lánchosszabbító csoport, előnyösen 1^1 szénatomos alkíléncsoport — reagáltatjuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy aktivátor gyökként 2-piridil- vagy 4-piridil-csoporlot használunk. 3. Eljárás melanoma tumorok kezelésére alkalmas gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely 1. igénypont szerinti eljárással előállított, a ricin A-láncához kapcsolt antimelanoma antitestet tartalmazó konjugátumot a gyógyszerkészítésben szokásosan használt hordozó- és/vagy segédanyagokkal összekeverve gyógyászati készítménnyé alakítunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 3 db ábra
