188314. lajstromszámú szabadalom • Eljárás melanoma kezelésére alkalmas készítmények előállítására
1 188 314 2 A találmány tárgya eljárás a melanoma tumorok kezelésére alkalmas konjugátum, és hatóanyagként azt tartalmazó gyógyászati készítmény előállítására. Az 1978. szeptember 28-i 78 27838. számú francia szabadalmi bejelentésben és az 1979. október 3-i, 79 24655. számú pótszabadalmi bejelentésben már leírták az úgynevezett konjugált rákellenes szereket, amelyeket úgy állítottak elő, hogy a ricin A-láncát kovalens kötéssel kapcsolták egy olyan fehérjeszerkezettel, például egy antitesttel, egy immunglobulinnal vagy egy immunglobulin-fragnienssel, amely a ráksejt felületére kapcsolódott antigén szelektív felismerésére képes, ezáltal a hatóanyagot a hatás helyére tudja juttatni. Ezeknek a konjugált szereknek fő jellemzője, hogy a célsejtekre nézve citotoxikusak. A rákos sejteket megkülönböztető antigénekkel szemben specifikus antitest alkalmazása már jelentős specificitást adott a konjugált szereknek a célsejtekkel szemben. A rákos sejtekhez kapcsolódó antigének jellemzése és ezen antigének elleni monoklonális antitestek előállítása pedig lehetővé teszi olyan konjugált szerek tervezését, amelyek még nagyobb specificitással kapcsolódnak az antigéneket hordozó célsejtekhez. A jelen találmány tárgya a ricin A-láncábó! és egy humán melanoma elleni monoklonális antitestből álló úgynevezett konjugált szerek előállítása. A konjugált szerek alatt mesterségesen előállított keverék-molekulákat értünk, amelyekben a ricin A-láncát diszulfidhid-típusú kovalens kötéssel kapcsoljuk egy humán antimclanoma antitesthez, amely képes szelektíven felismerni a rákos sejtekhez kapcsolódott antigént. A tiszta ricin A-láncának előállítása már korábbi szabadalmakból ismert. A humán melanoma tumorokkal szembeni specifikus monoklonális antitestek előállítása is ismert, például a [Proceedings of the National Acad. Sciences, 77, 2183 (1980)] irodalmi utalásban ismertetettmódon. A konjugált szerek előállításához a kapcsolandó fehérjemolekulában legalább egy kénatomnak kell lennie, vagy a kénatomot mesterségesen kell bevinni a proteinmolekulába, hogy a kívánt diszulfidhíd kialakítható legyen. A ricin A-láncában eredendően jelen van egy kénatom, így alkalmas a kapcsolási reakcióra. Ez a kénatom az A-láncban lévő cisztein-rész merkaptocsoportjában található és a teljes toxinban a ricin A- és B-láncának kapcsolódását biztosítja. Az antimelanoma antitestben sem szabad merkaptocsoport, sem más, a kapcsolásra alkalmas kénatom nincs. Ezért egy vagy több kénatomot mesterségesen kell bevinni az immunglobulin-molekulába, és ezek az atomok azután képesek a ricin A-láncának megfelelő egy vagy több molekuláival diszulfidkötés létrehozására. A találmány szerint a konjugált szert úgy állítjuk elő, hogy a ricin szabad merkaptocsoportot hordozó A-láncát reagáltatjuk egy antitesttel, amely mesterségesen bevitt, aktivált merkaptocsoportot tartalmaz, mégpedig egy kénatomot tartalmazó gyökkel alkotott vegyes diszulfidkötés formájában. A konjugált szer előállítását az A reakcióvázlattal szemléltetjük. A reakcióvázlatban RA a ricin A láncát AC az antitestet R egy olyan csoportot jelent, amely az Y és az —S-S-X szubsztituenshez egyaránt képes kötődni, és X az aktivátor gyököt jelenti. Az aktivált kénatommal helyettesített antitestet az antitestből állítjuk elő úgy, hogy azt kénatomot tartalmazó reagenssel szubsztituáljuk. A reakciót a B reakcióvázlattal szemléltetjük, a B reakcióvázlatban AC jelentése antitest, Y egy funkciós csoportot jelent, amely elősegíti a reagens kötődését a proteinen R egy olyan csoportot jelent, amely egyaránt képes kötődni az Y és az -S-S-X szubsztituenshez X az aktivátor gyököt jelenti. Az Y funkciós csoport olyan csoportot jelent, amely képes kovalensen kötődni a szubsztituálandó proteint alkotó aminosavak oldalláncaiban lévő bármely funkciós csoporthoz. Ezek közül különösen jelentősek a proteinben lévő lizil-gyökök terminális aminocsoportjai. Ebben az esetben Y jelenthet- karboxilcsoportot, ami kapcsolódni tud a protein aminocsoportjával egy kondenzálószer, például egy karbodiimid, különösen egy vízoldékony karbodiimidszármazék, például l-etil-3-(3-dietil-amino-propil)-karbodiimid jelenlétében,- karbonsavkloridot, amely képes az aminocsoportot közvetlenül acilezni,- aktivált észtert, például o- vagy p-nitro- vagy dinitro-fenil-észtert, vagy egy N-hidroxi-szukcinimid-észtert amely az aminocsoportot képes közvetlenül acilezni,- dikarbonsav gyűrűs anhidridet, például borostyánkősavanhidridet, amely az aminocsoporttal közvetlenül reagálva ainidkötést képes kialakítani,- egy (a) általános képletű imidoészter-csoportot- az (a) képletben Rí egy alkilcsoportot jelent — ami a protein aminocsoportjával a C reakcióvázlattal szemléltetett módon képes reagálni. X olyan funkciós csoportot jelent, amely szabad merkaptocsoporttal képes reagálni. Közelebbről, X jelenthet 2-piridil- vagy 4-piridil-csoportot, amely egy vagy több alkil- vagy karboxilcsoporttal vagy halogénatommal lehet szubsztituálva. X jelenthet előnyösen egy vagy több nitro- vagy karboxilcsoporttal szubsztituált fenilcsoportot is. X jelenthet aikoxi-karbonil-csoportot is, például metoxi-karbonil-csoportot. R gyök bármely olyan gyököt jelenthet, amely egyidejűleg képes az Y és az S-S-X szubsztituensekhez kapcsolódni. Úgy kell megválasztani, hogy' ne legyen benne olyan funkciós csoport, amely a következő reakciók során kölcsönhatásba léphetne a reagensekkel, vagy a keletkezett termékekkel. Közelebbről, az R csoport jelenthet például egy -(CH2)n- csoportot, n értéke 1-10 lehet, vagy egy (b) általános képletű csoportot - a képletben R4 jelentése hidrogénatom vagy 1-8 szénatomos alkilcsoport, R3 olyan szubsztituenst jelent, amely semleges a későbbiek során használandó reagensekkel szemben, például egy (c) általános képletű karbamátcsoportot, az utóbbi képletben Rs egyenes vagy elágazó szénláncú 1—5 szénatomos alkilcsoportot, előnyösen tere-butil-csoportot jelent. Az Y—R—S-S—X általános képletű vegyületet homogén folyadék fázisban, leggyakrabban vízben vagy puffer-5 10 15 2C 25 3C 35 40 45 50 55 60 65 2
