188298. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humánproteineket tartalmazó véralvadás-fokozó gyógyászati készítmény előállításáar

1

188 298

2

3. A maradékaktivitás kiszámítása:

A hatékonysági teszt leírásához hasonlóan egy kalibrációs görbét állítunk össze az azonnal meghatározott hígítások alvadási időiből (hígítatlan minta = 50 FEIBA-egység/ml). Az egy óráig inkubált különböző hígítások FEIBA-egység/ml aktivitásait a kalibrációs görbe segítségével számítjuk ki és a nem-inkubált hígítások aktivitásának százalékában fejezzük ki. Az így kiszámított aktivitás középértékei adják egy óra inkubációs idő után a minta átlagos maradékaktivitását, az inkubáció előtti kiindulási aktivitás százalékában kifejezve.

A IX-faktor maradékaktivitásának meghatározása a IX-faktor-hiányplazmában inkubálás után az alábbi módon történik:

1. Reagensek:

IX-faktor-hiányplazma: súlyos haemophilia B betegségben szenvedő paciens citrátplazmája (a IX-faktor 1% alatt).

Foszfolipid/kaolin-szuszpenzió: Az Immuno Diagnostica GmbH. cég PTT-reagense. A teszthez a szükséges IX-faktor-hiányplazma mennyiségét öszszekeverjük azonos térfogatú foszfolipid/kaolinszuszpenzióval, az elegyet 5 percig inkubáljuk 37 *C-on, miközben a teszt-periódus során jegesfürdőben tartjuk az elegyet.

Citrát-/konyhasó-oldat hígítószerként: 7 g/liter trinátrium-citrát ■ 2H2, 7 g/liter nátrium-klorid, kalcium-klorid m/20 (0,05 mólos): a teszt során 37 °C-on tartjuk.

2. Teszt:

Egy 50 IX-faktor-egység/ml-re beállított készítményből 7 geometriai sor szerinti hígítást állítunk elő (1:2, 1:4, stb. 1:128), citrát-/konyhasó-oldat segítségével. A hígítatlan mintából, valamint a 7 geometriai sorhigításból mindig egy 1:10 hígítást adtunk a IX-faktor-hiányplazmába (0,05 ml hígítatlan minta + 0,45 ml IX-faktor-hiányplazma).

A IX-faktor-hiányplazmában („inkubációs elegyek”) ezeket az 1:10 hígításokat azonnal és egy óra 37 °C-on történő inkubálás után analizáljuk a következő módszer szerint, miközben a meghatározás előtt minden inkubációs elegyet 1:10 arányban citrát-/konyhasó-oldattal hígítunk:

0,2 ml IX-faktor-hiányplazma és foszfolipid/ kaolin elegye

0,1 ml „inkubációs elegy”, 1:10 arányban hígítva citrát-/konyhasó-oldattal

1 percig 37 'C-on inkubálunk

0,1 ml m/20 kalcium-klorid.

Stopperórával mérjük a kalcium-klorid hozzáadásától az atvadék képződéséig eltelt időt.

3. A maradékaktivitás kiszámítása:

Az azonnal meghatározott hígítások alvadási időiből kalibrációs görbét készítünk (hígítatlan minta = 50 IX-faktor egység/ml), az alvadási időket a megfelelő hígításokkal szemben felvisszük dupla logaritmikus milliméterpapírra. Az egy óráig inkubált különböző hígításokban a IX-faktoregység/ml aktivitásokat a kalibrációs görbe segítségével számítjuk ki és a nem-inkubált hígítások aktivitásainak százalékában fejezzük ki. Az így számított aktivitások középértékei egy óra inkubálás után a minta átlagos maradékaktivitását adja az inkubáció előtti kiindulási aktivitás százalékában kifejezve.

Az inter-alfa-tripszin-inhibitor (ITI) immunológiai meghatározása:

I. Módszer:

A meghatározás az Ouchterlony-technikával történik, ennek során egy specifikus antitest diffundál egy antigén-tartalmú mintával szemben agarközegben. Az antigén specifikusan reagál az antitesttel egy immuncsapadéksávot képez és ezt pozitív reakciónak értékeljük.

2. Reagensek:

Nyúlból származó antiszérum ITI ellen, Behringwerke AG, Marburg/Lahn, Német Szövetségi Köztársaság

Agár: 1,25 g agar, 0,9 g nátrium-klorid és 100 mg nátriumazid 100 ml vízzel készített oldatát rövid ideig felforraljuk és a forró homogén oldatot kb. 2 mm rétegvastagságú lemezekre öntjük. A lehűtött, megmerevedett gélbe 5 mm-es távolságokra kb. 2 mm-es lyukakat készítünk két sorban.

Standard illetve minta:

Referencia anyagként a Behring cég definiált ITI-tartalmú protein standard széruma szolgál. Ebből a referencia szérumból geometriai hígítási sort készítünk fiziológiás nátrium-klorid oldatban (9 g nátrium-klorid/liter).

A vizsgálandó mintánál hasonlóan járunk el, mint a standardnál.

3. Teszt:

Az agar lyuksorba a viszonyítási anyag, illetve a vizsgálandó anyag hígításait helyezzük és a mellette lévő lyuksorba a hígítatlan specifikus antiszérumot pipettázzuk. Az így rétegzett agarlemezt 15 óráig inkubáljuk 37 °C-on. Ezt követőleg leolvassuk az immuncsapadékokat.

4. Az ITI-koncentráció kiszámítása:

Egy minta ITl-koncentrációjának kiszámításánál mértékül szolgál az a hígítási fok, amelynél még látható csapadék (a próba titere). A vizsgálandó minta ITI-koncentrációját az alábbi módon számítjuk ki:

a minta titere . j j , , • - •---------;—:—:------- x a standard ITI-koncentracioja

standard titere

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

6