188298. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humánproteineket tartalmazó véralvadás-fokozó gyógyászati készítmény előállításáar
1 188 298 2 A találmány szerint előállított készítmény további előnyös jellemzője, hogy a FEIB-aktivitás a Vili-faktor inhibitor plazmában 1 órás inkubálás után legalább 50%-ban megmarad. Ez a tulajdonság VIII faktor-inhibitor betegeknél történő alkalmazásnál tartós hatást jelent. A találmány szerint előállított készítmény további előnyös tulajdonsága, hogy 1 órás inkubálás után a IX faktor aktivitás legalább 50%-ban megmarad a IX-hiányplazmában. Ez azt jelenti, hogy a készítmény kevés vagy igen csekély részben tartalmaz aktivált IX faktort. Ismeretes, hogy az aktivált IX faktor a humán plazmában inaktiválódik. Az aktivált IX faktor hátrányos trombogén hatást okozna. Az irodalomból (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74. kötet, 7. szám, 3028-3032., 1977. július, „In vitro and in vivo correlation of clotting protease activity: Effect of heparin” S. N. Gitel, R. C. Stephenson és S. Wessler) ismeretes, hogy éppen a IXa faktor rendelkezik más aktivált alvadási faktorokkal, például a Xa és lia (trombin) faktorokkal szemben a legerősebb trombogén hatással. Végül, a találmány szerint előállított véralvadásfokozó készítmény további előnyös tulajdonsága, hogy FEIBA-egységenként 0,05-5 mg inter-alfa-tripszin-inhibitort (ITI) tartalmaz. Az ITI-tartalom azt eredményezi, hogy a találmány szerint előállított készítmény trombogenitása a Wessler-tesztben igen alacsony. A találmány szerint a humánprotein bázisú véralvadás-fokozó, II, VII, IX és X alvadási faktorokat tartalmazó és VIII-faktor-inhibitor-Bypassaktivitással rendelkező gyógyászati készítményt úgy állítjuk elő, hogy a humánplazmát szulfatált polimer szénhidrátokkal és/vagy bázikus ioncserélőkkel kezeljük és a kapott FEIB-aktivitással rendelkező protein-elegyet abszorbeáljuk, majd eluálással és koncentrálással kinyerjük. A találmány szerinti eljárásnál ügyelni kell arra, hogy a plazma, illetve a reakcióban részt vevő komponensek ne tartalmazzanak olyan anyagokat, amelyek képesek a III antitrombin aktivitást fokozni, ilyen anyagok például a heparin vagy a heparinoidok. A találmány szerinti eljárás előnyös foganatosítási módja szerint a plazmát először szulfatált, nagy polimerizációs fokú szénhidrátokkal kezeljük rövid ideig, majd a FEIB-aktivitással rendelkező proteinelegyet dextrán bázisú ioncserélőn adszorbeáljuk, közvetlenül ezután eluáljuk és bepároljuk. A találmány szerinti eljárás másik foganatosítási módja szerint a plazmát dextrán bázisú ioncserélővel kezeljük, majd az ioncserélőn adszorbeált FEIB-aktivitással rendelkező protein-elegyet legalább 2 órás behatás után eluáljuk, majd koncentráljuk. Ennél a kivitelezési módnál a FEIB-aktivitás keletkezése a kezelés időtartamától függ. Ez a kezelés 48 óráig tarthat. A használt eljárási intézkedések nem döntőek és széles határokon belül változhatnak, így a pH érték 6 és 9 között mozoghat, a hőmérséklet 0 és 40 °C között lehet, a dextránszulfát mennyisége 0,1-500 mg/liter plazma lehet és a DEAE-Sephadex-en 0,01—10 g/liter plazmát alkalmazhatunk. A találmány szerinti eljárásnál kiindulási anyagként nemcsak természetes humánplazmát, hanem plazmafrakciókat, például Kryo-maradékot és Cohn-I- maradékot (8% alkohol) is alkalmazhatunk. A találmány szerinti eljárást és az eljárással előállított készítményeket a következő példákban részletezzük és a példák után a meghatározási módszereket is megvilágítjuk, az eredményeket pedig táblázatokban foglaljuk össze. 1. példa 1000 liter frissen fagyasztott emberi citrátplazmát 0-4 °C-on felolvasztunk és a közben kicsapódó Kryo-csapadékot 2 °C-on centrifugálással elválasztjuk. A kapott Kryo-mardékot 7,7 pH értéken 10 g dextránszulfáttal (molekulasúly: 500 000) elegyítjük és az elegyet 15 percig 4 °C-on keverjük, közben FEIBA anyag keletkezik. Ehhez 500 g DEAE-Sephadex A-50 (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Svédország) gyantát adunk és fél óráig 4 "C-on keverjük. A keletkezett FEIBA-anyag a II, VII, IX és X protrombinkomplex faktorokkal és iners proteinekkel együtt az oldhatatlan DEAE-Sephadex-re adszorbeálódik. Az adszorpciós folyamat lejátszódása után közvetlenül a DEAE-Sephadexet centrifugálással vagy szűréssel elválasztjuk és a visszamaradó plazmát gamma-globulin és albumin kinyeréséhez használhatjuk. A DEAE-Sephadexet kétszer mossuk, eközben a DEAE-Sephadexet először 4 g/liter trinátríumcitrát • 2H20-ból, 7 g/liter nátrium-kloridból és 18 g/liter dinátrium-hidrogénfoszfát • 12H20-ból álló desztillált vizes oldattal mossuk pH = 7,5 értéken, miközben az elegyet 15 percig 4 °C-on keverjük. Szűréssel elválasztjuk és a kapott DEAE-Sephadex-et 50 liter, 4 g/liter trinátriumcitrát • 2H20 és 7 g/liter nátrium-klorid desztillált vizes oldatával pH = 7,5 értéken ismét mossuk, miközben 15 percig 4 °C-on keverjük, majd szűréssel elválasztjuk. Az eluálásnál a DEAE-Sephadex-et 25 liter, 30 g/liter nátrium-klorid és 1 g/liter trinátriumcitrát • 2H20 desztillált vizes oldatával pH = 7 értéken mossuk, miközben 20 percig 4 °C-on keverjük az elegyet. A keletkezett FEIBA anyagot, valamint a II, VII, IX és X protrombin-komplex faktorait és iners proteineket tartalmazó eluátumot leszűrjük és a DEAE-Sephadex-et elkülönítjük. Az eluátumot éjjel 1000 liter desztillált vízzel 4 °C-on dializáljuk, majd befagyasztjuk és először liofilizáljuk. A kapott anyagban meghatározzuk a FEIB-aktivitást, mégpedig a 2 734 821 számú német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási iratban leírt módszerrel. A gyógyászatiig felhasználható FEIB-hatású gyógyszerkészítmény előállításához a kapott nyersanyagot annyi desztillált, pirogénmentes vízben oldjuk, hogy a FEIB-aktivitás milliliterenként 10 és 50 FEIBA-egység között legyen (a konkrét esetben 25 FEIBA-egység/ml). A szükséges izotóniás sók hozzáadása után a pH-t 7 és 7,5 érték közé állítjuk, majd az oldatot membránszűrővel tisztítjuk, végül 0,2 pm membránszűrőn keresztül sterilen szűrjük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
