188298. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humánproteineket tartalmazó véralvadás-fokozó gyógyászati készítmény előállításáar
1 188 298 2 Az oldatot steril körülmények között 20 ml-es tartókba töltjük, mélyhűtjük és liofilizáljuk. 2. példa 1000 liter frissen fagyasztott humán citrátplazmát 0-4 ‘C-on felolvasztunk és az eközben kicsapódó Kryo-csapadékot centrifugálással 2 ‘C-on elválasztjuk. A kapott Kryo-mardékot 7,7 természetes pH értéken elegyítjük 500 g DEAE-Sephadex A-50 anioncserélővei (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Svédorszg) és félóráig 4 ‘C-on keverjük, eközben a II, VII, IX és X protrombin-komplex faktorok és az iners proteinek adszorbeálódnak a DEAE-Sephadex-re. Az elegyet 12 óráig 4 °C-on állni hagyjuk és eközben az „érintkezési idő” közben keletkezik a FEIBA anyag. A DEAE-Sephadex-et 12 órás „érintkezési idő” után centrifugálással vagy szűréssel elkülönítjük, a visszamaradó plazmát gamma-globulin és albumin előállításához használhatjuk. A DEAE-Sephadex további feldolgozása (kétszeres mosás, eluálás stb.) az 1. példában leírt módon történik. A trombózist előidéző aktivitás tesztet Wessler szerint, amelyet az irodalomban J. Appl. Physiol. 14 (1959), 943-946., „Biologic assay of a thrombosis-inducing activity in human serum”, Stanford Wessler, Stanley M. Reimer és Mindéi C. Sheps irodalmi helyen írtak le, a következőképpen hajtottuk végre: kísérletenként három nyulat használtunk. Az állatokat Nembutallal narkotizáltuk és lokális érzéstelenítés után a szívoldalon lévő véna jugulárist szabaddá tettük és 1-2 cm-es távolságban két ligatúrát (érlekötő vonal) készítettünk elő. A vizsgálandó készítményt a kívánt dózisban 15 másodpercen belül befecskendeztük a szabaddá tett véna jugulárissal szembeniévé fülvénába. A készítmény befecskendezése után 10-25 másodpercen belül összehúztuk az előkészített ligatúrákat. Az izolált vénaszegmens 10 percig in situ a nyálban maradt, Ezután a vénadarabot eltávolítottuk az állatból és 5%-os nátriumcitrát-oldatban egy Petricsészében felvágtuk és a tartalmát az alábbi értékelési skála szerint értékeltük ki. 0 = nincs alvadék 1 = kevés makroszkopikusan kimutatható fibrin részecske 2 = néhány kis vérrög 3 = kettő vagy több nagy vérrög 4 = egy egyetlen, az egész izolált vénaszegmenst kitöltő trombusz. A tesztet akkor minősíthetjük pozitívnak, hogy ha egy 4-es értéket kapunk. A találmány szerint előállított készítménynél lényeges, hogy a kísérleti állat súlyára számítva kilogrammonként legfeljebb 2 egység FEIBA-t tartalmazó készítmény injektálásánál 4-es reakció ne lépjen fel. A kallikrein- és a prekallikrein-aktivátor-aktivitást az alábbi módon határozzuk meg. Kallikrein: 1. Módszer: A kallikrein egy specifikus kromogén anyagról amidolitikusan para-nitroanilint (pNA) hasít le. A pNA koncentrációját 405 nm hullámhossznál fotometriásan mérjük. 2. Reagensek: Puffer: A oldat: 3,03 g „TRIS” és 1,7 g imidazol elegyét 500 ml 0,1 n sósavban oldjuk és vízzel a térfogatot , 1000 ml-re töltjük fel. B oldat: 4,04 g „TRIS”-t és 2,27 g imidazolt 500 ml 0,1 n sósavban feloldunk és vízzel 1000 ml-re töltjük fel. C oldat: 11,69 g nátrium-kloridot vízzel 1000 ml oldattá oldunk. Az a és B oldatot addig keverjük össze, míg a pH értéke 7,9-et el nem ér. Az elegyet azonos térfogatú C oldattal keverjük össze. Kromogén szubsztrát S-2302 (Kabi cég, Svédország): H-D-prolil-L-fenilalanil-L-arginin-p-nitroanilid-dihidroklorid 1 millimolos S-2302 oldat: 25 mg 41 ml vízben. A minta: A mintát az eredeti térfogatban feloldjuk és hígítatlanul használjuk fel a teszthez. 3. Teszt: 37 C-os vízfürdőben egy műanyag kémcsőbe 1 ml 37 °C-ra előmelegített puffert, 0,1 ml mintát és 0,2 ml kromogén S-2302 anyagot pipettázunk. Az elegyet 37 °C-ra melegített fotométerbe helyezzük és a percenkénti optikus sűrűség-növekedést (AOD/min) 405 nm hullámhossznál 10 mm rétegvastagságnál mérjük. A minta aktivitását AOD/ min egységben fejezzük ki. Prekallikrein-aktivátor: 1. Módszer: Egy tisztított prekallikrein-készítményből (PKK) prekallikrein-aktivátor segítségével (PKKA) kallikreint (KK) állítunk elő. A kallikrein egy specifikus kromogén anyagról amidolitikusan para-nitroanilint (pNA) hasít le. A pNA koncentrációját fotometriásan méljük 405 nm hullámhossznál. 2. Reagensek: A puffer és a kromogén anyag megfelel a kallikrein meghatározásnál leírt reagenseknek. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
