188298. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humánproteineket tartalmazó véralvadás-fokozó gyógyászati készítmény előállításáar
1 188 298 2 A találmány tárgya eljárás II, VII, IX, és X alvadási faktorokat tartalmazó és VIII faktor-Inhibitor-Bypass-aktivitással rendelkező humánprotein alapú véralvadás-fokozó gyógyászati készítmény előállítására. Ismeretesek VIII faktor Inhibitor-Bypass-aktivitással rendelkező, - rövidítése „FEIBA” - (Factor Eight Inhibitor-Bypassing Activity), véralvadásfokozó készítmények. A 4 160 025 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásnak, illetve a 2 734 821 számú német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási iratnak megfelelő 350 726 sz. osztrák szabadalmi leírásban leírták egy ilyen készítmény előállítását. A készítményt haemophilia A betegségben szenvedő betegek kezelésére alkalmazzák sikeresen, akiknek a vére a VIII faktor ellen ható inhibitort tartalmaz. A FEIBA-faktor kémiai szerkezete eddig még ismeretlen. Csak anynyit tudnak, hogy körülbelül 100 000 molekulasúlyú proteinről van szó. A fent említett szabadalmi leírások szerint a készítmény előállítása úgy történt, hogy szabad kalciumionok távollétében emberi citrát-ionokat tartalmazó plazmából képezték, oly módon, hogy a plazmát vízben nem oldódó szervetlen, véralvadás-fiziológiailag-felületaktív anyagokkal, például kovasavgéllei vagy kaolinnal kezelték, majd adszorbeálták és eluálták, így a II, VII, IX és X, valamint a FEIBA-faktor és más proteinek elegyét kapták, melynek összetétele eddig nincs leírva. Bár, mint említettük, a fenti 2 734 821 sz. német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási irat szerinti készítmény hasznosnak bizonyult a VIII- faktor inhibitor betegek kezelésében, a készítmény felhasználási területét azonban bővíteni kell, javítani kell továbbá a FEIBA-készítmények elviselhetőségét és különösen a minimálisra kell csökkenteni az olyan nemkívánatos mellékreakciókat, mint amilyenek a trombogén és vazoaktív hatás. A találmány szerint olyan humánprotein bázisú véralvadás-fokozó készítményt állítunk elő, amely II, VII, IX és X alvadási faktort tartalmaz, valamint VIII-faktor-Inhibitor-Bypass-aktivitással rendelkezik, és a készítményt az jellemzi, hogy- egy nyúl kilogrammjára számítva legalább két egység FEIBA-ig mentes trombogén aktivitástól a Wessler-féle trombózis-előidéző hatás-teszt szerint,- nem mutat kallikrein-hatást és prekallikreinaktivátor-hatást, ezt a készítmény vizes oldatában mértük legalább 10 egység/ml FEIBA-nál,- dextránszulfát-agarozon affinitáskromatográfiásan nátrium-kloríd-gradienssel oly módon választható szét, hogy a IX faktort tartalmazó protein alacsonyabb nátrium-klorid koncentrációnál eluál, mint a FEIBA értékkel rendelkező protein,- a IX faktort tartalmazó és a FEIBA értékkel rendelkező proteineket tartalmazó eluátumok elektroforetikus elválasztásnál a- és ß-globulinokat tartalmaznak és az elválasztási görbe az a-tartományban 60-80% összprotein-tartalomnak megfelelő főcsúcsot és egy 10- 20% összproteinnek megfelelő mellékcsúcsot, valamint egy ehhez kapcsolódó, ■> 10-20% összproteinnek megfelelő nem kifejezett csúcsot tartalmaz a ß-globulin-tartomanyban. A fent felsorolt jellemzők, azaz, hogy a készítmény mentes a trombogén és kallikrein, valamint prekallikrein-aktivátor hatástól, mely utóbbi hatások felelősek a vazoaktív hatásért, azt jelentik, hogy a készítmény jól tolerálható. A trombóziselőidéző-hatásteszt és a kallikrein-, valamint prekallikrein-aktivátor-hatástesztek szakember számára ismertek. A példák után azonban pontosan ismertetjük a teszteket. A találmány szerint előállított készítmény harmadik jellemzőjét, a dextránszulfát-agarózon affinitáskromatográíiás úton történő elválasztását nátrium-klorid-gradienssel, egy példa kapcsán az 1. ábrán mutatjuk be. Az affinitáskromatográfiás eljárás dextránszulfát-agarózon szakember számára általában ismert (D. S. Pepper és C. Prowse, Thrombosis Research 11 (1977), 687-692). A módszer során az 500 000 molekulasúlyú dextránszulfátot CNBr-aktivált Sepharose 4 B-re (Pharmacia Fine Chemicals UB, Uppsala, Svédország) kapcsoljuk. Az így kapott dextránszulfát-sepharózt 0,4%-os trinátriumcitrát • 2H20)-oldattal (pH = 7,4) pufferoljuk és egy oszlopba töltjük. A vizsgálandó mintát felvisszük az oszlopra, majd 0. 4%-os trinátriumcitrát • 2H20-ban (pH = 7,4) növekvő nátrium-klorid koncentrációjú nátriumklorid-oldattal frakcionáltan eluáljuk. Az 1. ábrán az abcisszán az eluátumok frakciószámai szerepelnek. A baloldali ordinátán milliliterenként az alvadási faktorok szerepelnek egységenként, a jobboldali ordinátán pedig mól/literben a nátrium-klorid-gradiens koncentrációját vittük fel. A gradiens lineáris lefolyását a G vonal mutatja. Az 1. ábrából kitűnik, hogy a IX-aktivitású faktort tartalmazó protein 0,1-0,5 moláris koncentrációnál eluál és a maximum 0,3 mólos koncentrációnál található, míg a FEIB-aktivitású protein 0,3-0,5 mólos nátrium-klorid koncentrációnál eluál, a maximum 0,4 mólos koncentrációnál található. A növekvő nátrium-klorid koncentráció a nátrium-klorid-grdiens G-ről ismerhető fel, amely 0-tól 0,65 mól nátrium-kloridig terjed. Végül a találmány szerint előállított készítményre negyedik jellemzőként megemlíthető a globulintartalom az elektroforetikus elválasztásnál, ezt a 2. ábrával szemléltetjük. A 2. ábra felső része a találmány szerint előállított IX faktort tartalmazó és FEIB-aktivitással rendelkező proteineket tartalmazó eluátumok elválasztási görbéjét mutatja dextránszulfát-sepharóz-kromatográfiával egy példa kapcsán, míg a 2. ábra alsó része egy természetes humán plazma elektroforetikus elválasztási görbéjét szemlélteti. Az ábrából kitűnik, hogy ennél a példánál a főcsúcs az a-globulin-tartományban 70% összprotein-tartalomról tanúskodik. A főcsúcshoz az a-globulin-tartományban egy mellékcsúcs kapcsolódik, amely 14% összprotein-tartalmat mutat, majd ehhez a mellékcsúcshoz a ß-globulin-tartományban egy kevésbé kifejezett csúcs kapcsolódik, amely 16% összproteint jelent. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
