188191. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a természetben előforduló ergolén vázas alkaloidot , az ergotamint tartalmazó drog parazita módon történő előállítására
1 188 191 2 A találmány tárgya eljárás a természetben előforduló ergolén-vázas alkaloidot, az ergotamint tartalmazó drog előállítására, rozsra virulens új Claviceps purpurea törzs spóratenyészetével. Az ergotamin hatóanyagot tartalmazó különféle ® gyógyászati készítmények a szülészetben, a nőgyógyászaiban, valamint a bel- és ideggyógyászatban egyaránt elterjedtek és régóta használatosak. Az ergotamin hidrogénezésével előállított dihidroergotamin hasonlóan fontos gyógyszeralapanyag. 10 Ismeretes továbbá az is, hogy a természetben előforduló ergolén-vázas alkaloidok két, egymástól eltérő módon állíthatók elő: - steril fermentációval, ún. szaprofita módon, vagy 15 - parazita eljárással rozs fertőzése útján. Ismeretes e két módszeren kívül totál szintézisük is, ez utóbbi azonban jelenleg még magas költsége miatt a gyakorlatban nem járható út. ' A szaprofita, ill. parazita úton történő anyarozs 20 alkaloidok előállítása közötti verseny ez ideig még nem dőlt el egyik módszer javára sem, ezért mindkét út továbbfejlesztése kötelező szükségszerűség. A találmány szerinti parazita módszer kidolgozásánál a következő célok vezettek bennv nket: 25- olyan új Claviceps purpurea törzs kinemesítése, amely az eddig ismerteknél lényegesen több alkaloidot tartalmaz.- a törzs fermentációs elszaporításával olyan oltóspórát lehessen előállítani, amely a rozs fertőzé- 30 sére alkalmas, továbbmenőleg ezen oltóspóra a felhasználásig stabil és nagyobb ergotamin tartalmú drog előállítását biztosítja. Parazita úton történő ergotamin törzsek már régóta ismertek (pl. a 155 148 magyar szabadalmi 35 leírás). E törzsek spóratenyészetével előállított drogok mintegy 4-5 mg/g alkaloidot tartalmaztak. A találmány szerinti eljárásban alkalmazott új törzs előállításának fontos lépései: 1. a Claviceps purpurea törzs kinemesítése, 40 2. a törzs fermentációs elszaporításával rozsfertőzésre alkalmas spórák előállítása és ezek konzerválása a felhasználásig, A találmány célkitűzése: jobb hozammal magasabb ergotamin tartalmú törzs előállítása, amely 45- mesterséges táptalajokon agar-agar felületen és süllyesztett levegőztetett tenyészetben jól spórázik;- a spórák megfelelően rezisztensek, tehát jól tartósíthatok;- a spórák életképesek és virulensek, tehát újra 50 táptalajközegbe juttatva 98-100%-ban kicsíráznak és rozsra juttatva azt fertőzik;- a területegységenként kifejlődő drog mennyisége magas;- a drog ergotamin tartalma magas, és a főalka- 55 loidon kívül csak jelentéktelen mennyiségű mellékalkaloido(ka)t tartalmaz. Az új törzs előállítását az alábbi módon végeztük: Vad gramineákról (Agropyron repens, Dactylus 0Q glomerata, Lohlium sp.) gyűjtött és rozsra szoktatott Claviceps populációkból indítottuk meg a szelekciót. A kiindulási populáció termelőképessége: 3,5 mg/g ergotamin. A kiindulási populáció házi jelzése K.Gy-19, amelyet az Országos Közegészségügyi Intézetnél (OKI) 00222 szám alatt helyeztünk letétbe. A kiindulási populáció az ivaros folyamatok következtében széles genotípus spektrumot és kiegyenlített életképességet biztosított. A szelekció során a plusz variánsok kiemelése nagyszériás analitikai módszerrel történt. További szelekció történt a plusz variánsok között a mikrobiológiai kezelhetőség szempontjából. Az ily módon kiemelt biológiai anyag ivartalan fenntartása, ill. felszaporítása következett parazita fertőzés céljából. A parazita életciklus alapján kapták a törzsek az utolsó gyakorlati szempontú minősítést. Az új törzs, amelynek házi jelzése KGy-1000 és amelyet az Országos Közegészségügyi Intézetnél (OKI) 00215 szám alatt helyeztünk letétbe, előnyös tulajdonságokkal rendelkezik. Az új törzs a fermentációs és termesztési eljárásokban az alábbi eredményt adja: OKI 00215 felületi spóratermelő képesség fermentlé spóraszáma oltóspóra készítmény csíraképessége ezer szem súlya droghozam (kísérleti üzemben) ergotamin tartalom mellékalkaloidok: ergometrin egyéb szennyezés, pl. zsíros olajtartalom Az új törzs (OKI 00215) morfológiai jellemzői: a) Maláta agart tartalmazó táptalajon (6 s% holland malátakivonat, 2 s% Difco-agar) 12-16 nap múlva fehér, rövid légmicéliumot képező telepeket képez, átmérőjük 2,0-2,5 p. A táptalajból 3-4 mmre kiemelkednek a telepek. 16-20 nap múlva a légmicéliumokon tömegesen képződik 2,5-4 p-os konidio-spóra. b) Tripkazin, glükóz, citromsav tartalmú szubmers táptalajon dús, köteges, elágazást nem mutató nicélium tömeget hoz létre. 50-60 óra múlva a micéliumok felülete hullámos lefutású, majd megindul a konidiumtartó kialakulása, amelyen lefüződnek a konidiospórák. Átlag méretük: 2,5-5,0 p. c) Citrátot, mannitot (lásd példa) tartalmazó szubmers kultúrában kezdetben köteges, kevés elágazódást mutató micéliumot képez. 38-40 órás korban megindul a konidio-spóra képződése, amely 5-6 nap múlva eléri az 5-108 spóra/ml értéket. A kialakult spórák mérete 3-6 p. A találmány szerinti eljárás közelebbről az alábbi példával szemléltethető. 1,8T09 spora/cso 5,5-6-108 spóra/ml 95-98% 180-200 g 250-300 kg/ha 9-10 mg/g 0,1-0,3 mg/g 20-25% Példa Az OKI-nál 00215 szám alatt deponált törzs 24 napos maláta-agar (6 s% holland maláta) tenyésze-2
