188073. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2,5-diketo-D-glükonsav előállítására
1 188 073 2 Amikor az Erwinia amylovora tulajdonságaival hasonlítottuk össze, a következő jelentős különbségeket állapítottuk meg: (i) Ciszteinből hidrogénszulfidot fejleszt. (ii) 36 °C-on vagy ennél magasabb hőmérsékleten tenyészik. (iii) Nitrátot nitritté redukál. (iv) Zselatint nem folyósít el. (v) Szalicinból, xilózból, melibiózból, cellobiózból és mannózból savat termel. (vi) Ribózból savat nem termel. Másrészt, amikor ezt a törzset az SHS-2008 törzzsel hasonlítottuk össze, azt találtuk, hogy ennek tulajdonságaival megegyezik, kivéve azt a pontot, hogy ribózból vagy glicerinből nem termel savat; ezért az SHS-2011 törzset a fentebb definiált Erwinia terreus variánsaként azonosítjuk. Az elkülönített mikroorganizmusokon (vad törzsek) kívül bármely ezekből kapott spontán mutánst a találmány szerinti eljárásban szintén előnyösen használni lehet, feltéve, hogy 2,5-diketo-D- glukonsavat képesek termelni, és ezért felesleges külön hangsúlyozni, hogy bármely, az ilyen izolált mikroorganizmusból mesterséges vagy induktív mutációval vagy módosítással kapott törzs, amely a kívánt tulajdonságokat mutatja, a törzsek alkalmas szelídítésével a jelen találmány kivitelezésére szintén akadálytalanul felhasználható. Az említett mikroorganizmusok fő szénforrásként D-glükózt, nitrogénforrásként folyékony kukoricalekvárt és kis mennyiségű szervetlen sót tartalmazó vizes táptalajban bőségesen fejlődnek. Aerob tenyésztés esetén nagyon nagy D-glükózkoncentrációjú közegben a 2,5-diketo-D-glukonsav (2,5-DKG) termelésére használt más ismert mikroorganizmusokkal összehasonlítva, igen jó kitermeléssel, elegendő stabilitással termelik ezt a kívánt vegyületet. A D-glükóz koncentrációja a folyékony táptalajban különleges kívánság esetén 40 súly/térfogatszázalék is lehet, de általában a 2,5-diketo-D-glukonsav gazdaságos termelése érdekében ezt a koncentrációt 15 súly/térfogatszázalék és 25 súly/térfogatszázalék között, előnyösen körülbelül 20 súly/térfogatszázalékon célszerű tartani. A fermentlé hőmérséklete 15 °C és 35 °C között, előnyösen 20 °C és 30 °C között, különösen előnyösen 28 °C lehet. A közeg pH értéke kezdetben 5,5-7,5, előnyösen 6,0-7,0. A folyékony táptalaj pH-értékét a fermentálás folyamán előnyösen 4,0 és 5,5 között tartjuk, hogy pufferoló hatású alkalmas szervetlen sókat adunk a fermentálás megkezdésekor a folyékony táptalajhoz, vagy a fermentálás előrehaladtával folyamatosan alkalmas bázist adagolunk. A só például kalciumkarbonát és a bázis például nátriumhidroxid lehet. A beoltott fermentlét percenként 1740 fordulattal működő keverővei állandóan keverjük, és percenként 600 ml nitrogénnel levegőztetjük. A fermentálást akkor fejezzük be, amikor a D-glükóz 2,4-diketo-D-glukonsavvá való átalakulása 90% kitermelésnek felel meg; ezt a fermentálás megindítása után 17-31 óra alatt érjük el. A keletkezett 2,5-diketo-D-glukonsavat vagy sóját a fermentléből bizonyos kezelés, például pH- beállítás után kristályos alakban különíthetjük el, vagy másképpen a fermentlét mint olyant a következő lépésben előnyösen táptalajként hasznosíthatjuk. A 2,5-diketo-D-glükonsavat tartalmazó fermentlét például közvetlenül lehet 2-keto-L-glukonsav előállítására használni, és így a szokásos módszerrel összehasonlítva, ezt az utóbbi vegyületet egyszerű eljárással és nagy kitermeléssel lehet kinyerni. Az előbb ismertetett fermentáláson kívül a jelen találmány úgy is kivitelezhető, hogy a mikroorganizmusok bármely kezelt termékét D-glükózt tartalmazó vivőanyaggal érintkeztetjük. Ilyen esetekben a fent leírthoz hasonló körülményeket a csíraképes sejtek tenyésztével kapcsolatban szintén lehet a vivőanyagban levő termékek inkubálására alkalmazni, és az átalakulás az érintkeztetés kezdetekor azonnal megindul. Az előnyös megvalósítások ismertetése A következő példákban a találmányt részletesebben magyarázzuk. 1. példa 1. Oltóanyag táptalaj A vizes oldatban van: D-glükóz (víztartalmú, 1,0 súly/térfogatszázalék 91%-os) kukoricalekvár 5,0 súly/térfogatszázalék káliumdihidrogénfosz- 0,1 súly/térfogatszázalék fát magnéziumszulfát- 0,02 súly/térfogatszáza•7 H20 lék kalciumkarbonát 0,5 súly/térfogatszázalék Az oldat pH-ját nátriumhidroxid vizes oldatával 6,8-7,0-ra állítjuk be, és 50 ml-es részletekben 500 ml-es sterilizált Erlenmeyer lombikokba töltve, oltóanyag táptalajként használjuk. 2. Oltóanyag tenyésztés A lombikba töltött táptalajok mindegyikét a 3. táblázatban felsorolt törzsek egy huroknyi mennyiségével beoltjuk, és 28 °C-on 8 óra hosszat percenként 270 lökettel (lökethossz 71 mm) rázzuk. A tenyésztést akkor fejezzük be, amikor a közeg optikai sűrűsége 8 (végpont). 3. Fermentlé A vizes oldatban van: D-glükóz 20,0 súly/térfogatszázalék kukoricalekvár 3,0 súly/térfogatszázalék káliumdihidrofoszfát 0,1 súly/térfogatszázalék kalciumkarbonát 0,3 súly/térfogatszázalék Az oldat pH-ját 6,8-7,0-ra állítjuk be, és 455 ml-es részletekben 1 literes fermentáló edényekbe töltjük. Az így kapott fermentlé mindegyikébe 45 ml fentiek szerinti oltóanyagot adunk. 4. Fermentálás A fermentálást a következő körülmények között hajtjuk végre: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
