188073. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2,5-diketo-D-glükonsav előállítására
1 188 073 2 hőmérséklet 28 °C; keverés percenként 1740 fordulattal; levegőztetés percenként 600 ml nitrogénnel; fermentálás időtartama 17-31 óra. 5. Meghatározás ' A terméket szűrőpapíron felfelé szálló papírkromatografiával az alábbi körülmények között határozzuk meg, és a foltokat denzitometria segítségével mennyiségileg is meghatározzuk. (i) Vivő szűrőpapír: Toyo Roshi 50 sz. (ii) Futtató oldószer: 75:4:25 arányú fenolhangyasav-víz elegy (iii) Foltok előhívása: A futtatás után a szűrőpapírt olyan 100 ml n-butalollal porlasztjuk be, amely vízzel van telítve, és 0,93 g anilint és 1,66 g ftálsavat tartalmaz. A kromatogramot 2 percig 105 °C-on kezeljük. (iv) Szín és Rf érték: Anyag Szin Rf érték 2,5-diketo-D-gIukonsav barna 0,16-0,18 2-keto-D-glukonsav rózsaszínű 0,27-0,29 D-glukóz barna 0,48-0,50 Ezenkívül vékonyrétegkromatografálást is végeztünk, és erre a célra Merck-féle E jelű alumíniumlemez-cellulóz vékonyréteget és a fent leírt futtató oldószerrendszert és foltelőhívó módszert alkalmaztunk. Ebben az esetben a meghatározást úgy hajtottuk végre, hogy a vizsgált anyag kromatogramját a hiteles mintával kapott kromatogrammal hasonlítottuk össze. 6. A fermentálás befejezése A fermentálást abban az időpontban fejezzük be, amikor a 2-keto-D-glukonsav rózsaszínű foltja a papírkromatogramon vagy vékonyrétegkromatogramon eltűnik. 7. Eredmények 3. táblázat SHS tör. Oltótenyészet zsek Befejezéskor pHH érték optikai sűrűség időtartam órák Fermentáló tenyészet Befejezéskor 2,5-diketo-D-glukonsav pH érték optikai sűrűség időtartam órák kon- glücentrá- kózra ció számisúly/ tolt térfo- kitergat % mêlés V A 2. és 3. példák Termelés sejtszuszpenzióval és nyers enzimkivonattal: 5 LA mikroorganizmus sejtek tenyésztésére használt táptalaj: A vizes oldat a következő anyagokat tartalmazza: Élesztőkivonat (Daigo Eiyo Yakuhin K. K. cég 10 gyártmánya) 0,1 súly/térfogatszázalék káliumdihidrogénfoszfát 0,1 súly/térfogatszázalék nátriumszulfát-7 H20 0,02 súly/térfogatszázalék kalciumkarbonát 0,6 súly/térfogatszázalék 15 Az oldat pH-ját 7,0-ra állítjuk be, és 80 ml-es részletekre osztva, 500 ml-es Erlenmeyer lombikokba töltjük. 2. A mikroorganizmus sejtek összegyűjtésére és a 20 nyers enzimkivonat elválasztására szolgáló tenyészetek Ezeknek a táptalajoknak mindegyikét a 4. táblázatban felsorolt törzsek egyikével az 1. példában leírt módon beoltjuk, és 28 °C-on, 16 óra hosszat 25 percenként 270 lökettel (lökethossz 71 mm) rázzuk. A rázás befejezése után a mikroorganizmus sejtjeit a tenyészet centrifugálásával elválasztjuk, nátriumklorid oldattal kétszer mossuk, és két részre osztjuk. 30 Az egyik részt nátriumklorid oldatban újra szuszpendáljuk, és így sejtszuszpenziót kapunk. A másik részt 1/50 mólos trisz-sósav pufferoldatban (pH-ja 7,5) szuszpendáljuk, a sejteket ultrahanggal kezelve roncsoljuk, és az oldhatatlan ma- 35 radékot centrifugálással eltávolítjuk, hogy felülúszóként sejtmentes nyers enzimkivonatot kapjunk. 3. Inkubálás sejtszuszpenzióval 40 5 súly/térfogatszázalék D-glükózt tartalmazó 1/10 mólos 3,3-dimetil-glutársav pufferoldatban (pH értéke 5,0) a sejtszuszpenzió koncentrációját úgy állítjuk be, hogy az optikai sűrűség 660 mp-nél 10 legyen. A keveréket 10 ml-es részletekre osztjuk 45 fel, 23 mm átmérőjű s 196 mm magas kémcsövekbe töltjük, és 28 *C-on, 3 óra hosszat inkubáljuk. Ezután a keveréket tartalmazó kémcsöveket centrifugáljuk, és a kapott felülúszó folyadékot papírkromatográfia segítségével elemezzük. A kapott 50 eredményeket a 4. táblázatban foglaljuk össze. A táblázatban a keverék inkubálása előtti D-glukóz koncentrációját szintén feltüntettük. 55 4. táblázat Koncentrációk 3 órai rázás után 2003 2004 7.0 6.0 10,0 8,5 ' 8 8 5,4 4,9 12,3 12,0 18 17 19 19 88 89 SHSD-glükóz °/ inViitválác 2-keto-D-2,5-diketo-D-2005 6,9 9,5 9 5,1 12,6 20 19 86 törzsek (»lőtt glukonsav % glukonsav % 2006 5,9 7,5 8 4,7 12,0 21 19 89 60 ------------2007 6,0 7,0 8 4,9 12,6 17 19 89 2003 4,9 2,7 0,8 1,9 2008 5,6 3,1 10 5,3 12,4 29 17 70 2004 5,0 1,9 0,7 1,5 2009 5,8 3,4 10 5,7 12,4 21 18 79 2005 5,0 2,6 0,6 0,7 2010 5,4 2,5 10 5,4 12,8 31 18 75 2006 5,0 1,9 0,9 U 2011 5,3 2,4 10 5,1 12,2 31 17 75 65 2007 5,0 1,4 0,3 1,4 9
