188058. lajstromszámú szabadalom • Eljárás királis benzil-merkapto-propionil-amino-származékok előállítására
1 188 058 2 England Nuclear., Boston, MA., USA) álló keveréket 1 órán át inkubáltunk 37 °C hőmérsékleten 1,8 ml-es polietilén kémcsövekben (Beckman Microfuge kémcsövek, Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, Cal., USA), 3-3 ismétlésben. A kontroll kémcső-széria vakpróbaként 10 percen át 100 °C-on forralt enzimet tartalmazott. A reakciót úgy állítottuk le, hogy a kémcsöveket 10 percen át forraltuk, majd 1 percen keresztül Beckman Microfuge centrifugán centrifugáltuk. Mindegyik felülúszó 10-10 pliteres alikvot részletét vékonyrétegkromatográfiás lemezre cseppentettük (Silica Gel 60, 20 x 20 cm-es lemezek, E. Merck, Darmstadt), lemezenként 1-8 mintát vittünk fel. Mindegyik, inkubált keveréket tartalmazó csepp tetejére 10-10 pliter, 0,4 mg/ ml tirozinból (Mann Research Laboratories, Inc., New York, NY., USA), 1 mg/ml L-tirozil-glicinből (Sigma), 1 mg/ml L-tirozil-glicil-glicinből (Sigma) és 1 mg/ml leucin-enkephalinból álló standard keveréket (Calbiochem-Behring Corp., La Jolla, CA., USA) csöppentettünk, és mindegyik lemezre zónaazonosítás céljából külön is felcsöppentettünk 10 plitert ebből a standard keverékből. A lemezeket megszárítottuk és 100-100 ml 2:2:1 arányú izopropanol-etil-acetát-5%-os ecetsav elegyet tartalmazó, lefedett üveg tartályokba helyeztük őket. A kifejlesztés után az elkülönült anyagokat oly módon tettük láthatóvá, hogy a lemezeket 0,5 súly/térfogat% ninhidrint tartalmazó acetonnal bepermeteztük, majd 10 percen keresztül vákuums/árítószekrényben 100 °C hőmérsékleten melegítettük őket. A standard jelölő anyagok Rrértékei: tirozin: 0,33, L-tirozil-glicin: 0,20, L-tirozil-glicilglicin: 0,13, leucil-enkephalin: 0,47. A radioaktív foltokat a hozzáadott jelölő anyagok alapján azonosítottuk és szcintillációs kémcsövekbe kapartuk őket, majd a kémcsövekbe 1-1 ml etanolt, majd 10 10 ml Aquasol-2-t (New England Nuclear) juttattunk. A kémcsöveket éjszakán át állni hagytuk, majd folyadék szcintillációs számlálóval megmértük a radioaktivitásukat. Az L-tirozil-glicil-glicin képződést ennek a zónának a percenkénti összbeiités száma és a forralt enzimet tartalmazó vakpróba megfelelő értéke közötti különbség adja. Az aktivitást azzal a gátló mólkoncentrációval (IC50, M) adjuk meg, amely a normál enzimaktivitást 50"u-kal gátolja. Az alábbi I. táblázatban különböző, találmány szerinti eljárással előállítható vegyületekkel kapott eredményeket tüntetünk fel a thiorphan-nal kapott eredményekkel összehasonlítva. I. táblázat Enkephalináz gátlás Vegyület képlet-X R n R1 IC*,. M száma (1) —H — H 2-ch3 4,8 • 10'7 (II) — H —H 2-ch3 9,6 • 10 6 (III)-9,1 • 10 9 (IV)-7 • 10 8 Thiorphan 1,5 ■ 10~8 A találmány szerinti eljárással előállítható vegyületek fájdalomcsillapító hatásának a meghatározásához kémiai fájdalomátvivő ingert, azaz fenilbenzokinon beadása után a hasüregfeszülés blokkolását használtuk. A kísérlethez Carworth CF-1 törzsbe tartozó egereket használtunk, erre a törzsre ugyanis az a jellemző, hogy különösen tiszta feszülési reakciót mutat. A kísérletben vizsgált állatokat a kísérlet megkezdése előtt 15-16 órán át éheztettük. Dózisonként 15 15 darab, 5-ös csoportokra osztott, 11-15 g súlyú egeret használtunk. A vegyületeket orálisan vagy szubkután adtuk be, orális beadás esetén 1 órával és szubkután beadás esetén 20 perccel a kezelés előtt. Ezután az egerekbe páronként intraperitoneálisan 2 mg, kg fenil-benzokinont injektáltunk és 28 x 18 x 25 cm-es átlátszó dobozba helyeztük őket, a dobozt termosztáttal szabályozott vízfürdővel 40 °C hőmérsékleten tartottuk. 5 perc múlva megkezdtük az állatok figyelését, és megszámoltuk, hogy az állatok 5 perc alatt hány hasfeszülési reakciót mutattak. A feszülés a has időszakos összehúzódását, a hátsó láb kinyúlását, medence forgatást vagy hálmerevgörcsöt (az egér hasa a ketrec alját érinti és az egér a ketrec hosszában vonszolja) jelent. A fájdalomcsillapító hatás mértékét a vonaglás visszaszorítása alapján számitjuk ki a kontroll állatok ugyanazon a napon mért reakciójához viszonyítva (% MPE). Az alábbi II. táblázatban néhány találmány szerinti eljárással előálított vegyülettel végzett kísérlet eredményét adjuk meg. A kísérlet azt mutatja, hogy a vegyületek jól használhatók fájdalomcsillapító szerekként. II. táblázat Hasmegfeszülés %-os blokkolása (% MPE) fenilbenzokinon beadása után Vegyüld képldszáma X R n R' MPE Dózis (s.c.) (mg/ kg) 100 320 (I) H H 2 ch3 69 233 23 170 (I) 4-och3 H 2 ch3 62 320 (I) 4-Cl H 2 ch3 86 320 (ID H H 2 ch3 (a) 320 (11) 4-och3 H 2 ch3 46 320 (II) 4-Cl H 2 ch3 75 320 (III)-57 160 (IV)-48 160 Megjegyzés: (a): ennek a dózisnak az esetén nem tapasztaltunk hatékonyságot. A találmány szerinti eljárással előállítható vegyületek görcsoldó hatását egereken végzett kísérletekkel határoztuk meg. 17-21 g súlyú Charles River, Swiss CD törzshöz tartozó hím egereket a kísérlet megkezdése előtt 18 órán át éheztettünk. Az egércsoportokat ezután a vizsgálandó vegyületek bizonyos dózisaival kezeltük, majd a szaruhártyában elhelyezett elektródokon keresztül 0,2 másodpercig tartó 50 mA-es 60 Hz frekvenciájú, görcsöt kiváltó elektrosokkot (ECS) kaptak. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
