188058. lajstromszámú szabadalom • Eljárás királis benzil-merkapto-propionil-amino-származékok előállítására
1 188 058 2 indulási anyagként előnyösen a megfelelő királis savat alkalmazzuk. A Q védőcsoportot a szokásos szolvolízises módszerekkel távolítjuk el szelektíven, ehhez általában valamilyen erős bázist használunk vízben és/vagy valamilyen alkoholt, adott esetben a reakcióval szemben közömbös, elegyedő szerves oldószer jelenlétében. Előnyösen úgy járunk el, hogy egy aciltio-vegyületet vízmentes metanolban legalább egy mólekvivalens nátrium-metiláttal reagáltatunk. A gyakorlatban általában legfeljebb 20 mól% fölöslegben alkalmazzuk a nátrium-metilátot. Á hőmérséklet nem kritikus (például nagyon alkalmas a 0-50 °C), előnyösen szobahőmérsékleten végezzük a reagáltatást. A fenti szintézisben kiindulási anyagként alkalmazott racém savakat könnyen előállíthatjuk egy tiokarbonsav és a megfelelő 3-fenil-2-metilénpropionsav kondenzálásával, ezt az eljárást a B) reakcióegyenlet ábrázolja. Ezeknek a savaknak a királis alakjait kívánt esetben úgy állítjuk elő, hogy egy királis aminnal (például d( + )-a-metil-benzil-aminnal) sót képezünk, majd a diasztereomer sókat az irodalomból jól ismert frakcionált kristályosítással elválasztjuk. A fenti szintézisekhez szükséges királis aminoalkoholok sok esetben a kereskedelemből beszerezhetők vagy a kereskedelemben kapható királis savak észterezésével és az észterek hidrides redukciójával vagy pedig az irodalomból ismert módszerekkel állíthatók elő, így például a C) reakciósorozattal ábrázolt módon, ahol a képletekben R, n és R1 a fenti jelentésű. A királis amino-alkoholt a hagyományos módokon is előállíthatjuk (a) általános képletnek megfelelő prekurzor sav királis aminnal végzett rezolválásával vagy pedig az (a) általános képletnek megfelelő prekurzor sav, a (b) általános képletnek megfelelő észter vagy a (c) általános képletnek megfelelő alkohol királis savval való rezolválásával. A (III) és (IV) képletü karbonsavakat hasonlóképpen állíthatjuk elő egy védett merkaptosav és L-metionin-észter összekapcsolásával, ezt a D) reakcióegyenlet mutatja be, ahol a képletekben Q a fenti jelentésű és R2 egy hidrolizissel eltávolítható sav védőcsoportot jelent. Erre a célra különösen alkalmas a legegyszerűbb észter, azaz az olyan vegyület, amelyben R2 metilcsoportot jelent. Az öszszekapcsolást ugyanúgy végezzük, mint a védett merkapto-sav és amino-alkoholok fentiekben ismertetett összekapcsolását. Ebben az esetben azonban kívánt esetben a sav-kloridot (vagy a sav más, alkalmas aktivált alakját) fölöslegben alkalmazhatjuk, minthogy az amino-észterben nincs jelen alkohol-csoport. A diasztereomerek elválasztását itt is a fentiekben leírt módon végezhetjük el vagy kiindulási anyagként ebben az esetben is alkalmazhatunk királis savakat. A Q és R2 védöcsoportokat itt is szolvolízissel távolítjuk el, általában egyidejűleg legalább két ekvivalens erős bázist alkalmazva. Különösen előnyös, ha a hidrolízishez kis fölöslegben levő vizes nátrium-hidroxidot használunk vízzel elegyedő, közömbös szerves oldószerben, például rövidszénláncú alkoholban vagy 1,2-dimetoxietánban. Az eljárás - ellentétben a bevezetőben említett ismert eljárásokkal - rendkívül egyszerű. A (III) és (IV) képletű vegyületek gyógyászatilag elfogadható kationt tartalmazó sóit könnyen előállíthatjuk úgy, hogy a savat valamilyen segédoldószerben megfelelő bázissal reagáltatjuk, a bázist általában ekvivalens mennyiségben alkalmazzuk. Alkalmas bázis például a nátrium-hidroxid, nátrium-metilát, nátrium-etilát, nátrium-hidrid, kálium-metilát, magnézium-hidroxid, kalcium-hidroxid, ammónium-hidroxid, N,N-dibenzil-etiléndiamin, kolin, dietanol-amin, etilén-diamin, N-metil-glükamin, N-benzil-fenetil-amin, dietilamin, piperazin és 2-amino-2-hidroxi-metilpropán-l,3-diol. A sót szárazra párlással vagy egy - a sót nem oldó - oldószer hozzáadásával nyerjük ki. Bizonyos esetekben a sókat úgy is előállíthatjuk, hogy a sav oldatát a kation egy másik sójának (például nátrium-etil-hexanoátnak, magnéziumoleátnak) az oldatával keverjük össze és olyan oldószert alkalmazunk, amelyben a kívánt só kiválik, de a sót betöményítéssel és/vagy a sót nem oldó oldószer hozzáadásával is elkülöníthetjük. Ha az elkülönítéshez vagy tisztításhoz olyan sót használunk, amelyet általában nem tartanak gyógyászatilag elfogadhatónak, ezt a sót könnyen szabad savvá alakíthatjuk oly módon,a hogy a só vizes szuszpenzióját vagy oldatát megsavanyítjuk, vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel extraháljuk és az extraktumot bepároljuk. A találmány szerinti eljárással előállítható vegyületek enkephalináz enzim gátlását in vitro vizsgáltuk az alábbi módon. Az enzim előállítása céljából 200-250 g súlyú Srague-Dawley CD hím patkányokat (Charles River Breeding Laboratories, Inc., Wilmington, MA., USA) lefejeztünk és agyukat (minus cerebellum) eltávolítottuk. A szövetet 30 térfogatrész (súly/térfogat) 50 mmólos jéghideg tri(hidroxi-metil)-metil-amin-hidroklorid pufferben (trisz-HCl-puffer, pH-értéke 7,7, gyártja Fisher Scientific Co., Fair Lawn, NJ., USA) homogenizáltuk (Polytron, Brinkmann Instruments, Inc., Westbury, NY., USA). A homogenizálumot 15 percen át 50 000 g gyorsulással centrifugáltuk. A pelletet 50 mmólos, 7,7 pH-értékü trisz-HCl-pufferben újra szuszpendáltuk, és 15 percen keresztül 50 000 g gyorsulással centrifugáltuk. A keletkező pelletet további 3 alkalommal újra szuszpendáltuk és centrifugáltuk a fenti módon, a membrán pelletet 15 térfogatrész 7,7 pH-értékü, 1% Triton X-100-at (Rohm und Haas, Philadelphia, PA., USA) tartalmazó trisz-HCl-pufferben diszpergáltuk, és 45 percen át 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. Ezt követően 60 percen keresztül 100 000 g gyorsulással centrifugáltuk, majd az oldhatóvá tett enzimet 2 ml-es alikvot részletekben megfagyasztottuk (ez a készítmény fagyott állapotban 3 hónapig tárolható). Az enkephalináz gátlás meghatározása céljából 90 pliter 50 mmólos, 7,7 pH-értékü, 3,2 mmol puromicin-dihidrokloridot tartalmazó trisz-HCI-pufferből, 200 pliter oldható pufferből (amely az enzim előállításának utolsó lépéséből származik), 5 pliter (vízben különböző koncentrációkban feloldott) inhibitorból, 200 pliter enzimből és 5 pliter 144 nmólos 3H-leucín-enkephalinból (26,8 Ci/mmol, New i 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
