187734. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fogszuvasodás elleni antigén- készítmények és ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 . 187 734 2 25 30 a) az Ingbritt törzset félig definiált táptalajon [Russel, FEMS Microbiol. Lett., 6,197-199 (1979)] tenyésztettük a korai stacioner fázisig, majd a sejteket centrifugálissal elválasztottuk és üvegszálszűrőn szűrtük. A szűrlethez protéáz inhibitorként 5 1 mmól végkoncentrációban fenil-metil-szulfonilfluoridot (PMSF) és 0,02% mennyiségű, baktériumnövekedést gátló nátrium-azidot adagoltunk, majd átengedtük egy affinitásos kromatografáló oszlopon. Az oszlop töltete oldhatatlan glükóz- 10 polimerből (mután) [B. Guggenheim, Helv. odont Acton, 14 (Suppl. V.) (1979) 89] és agáróz gél gyöngyökből (Sepharose CL-6B, gyártó: Pharmacia Fine Chemicals, Hounslow, UK) állt, amelyeket Rus1 sei szerint (J. gen. Microbiol., 112, 197-201 (1979)] 15 készítettünk. így eltávolítottuk a glükozil-transzferáz enzimeket és más dextránkötő proteineket, amelyek a később alkalmazott immunoszorbens oszlopokon megkötődnének [Russel, FEMS Microbiol. Lett. 11, 279 (1981)]. A tenyészet szűrletét 20 ezután egymást követően három immunoszorbens oszlopon eresztettük át, melyeknek töltete rendre tartalmazza a következőket is: i) A antigénre monospecifikus antitestet, fi) B antigénre monospecifikus antitestet, fii) sejtfalak elleni antitestet. A harmadik oszlop így az A, B és C antigének antitestjeit egyaránt tartalmazza, de az első két oszlop az A és B antigéneket már megkötötte, így a szűrlet a harmadik oszlopra érve már csak a C antigént tartalmazza. Ily módon ez az oszlop már csak a C antigént köti meg, amelyet erre a célra alkalmas anyaggal, így 3 mól/l-es nátrium-tiocianát oldattal a töltetből kivonhatunk. Az immunszorbens oszlopokat a szokott módszerrel készítet-: tűk úgy, hogy a szérumok immunglobulin G frakcióit térhálósított agaróz gyöngyökhöz (CnBr-activated Sepharose 4B, Pharmacia Fine Chemicals Ltd.) kapcsoltuk a gyártó cégek ajánlott módszere szerint. A fentiek szerint készült C antigént alkalmaztuk ezután a monospecifikus antiszérum előállításához. A C-specifikus immunszorbens oszlopok alkalmazása lehetővé tette, hogy az antigén tisztítását egy lépésben végezzük. b) A C antigén tisztítását egy másik módszer szerint immunszorbens affinitásos kromatográfiával, majd ezt követően hidrofób-kölcsönhatásos kromatográfiával végeztük. Ennél az eljárásnál a tenyészet szűrletét először mután és szefaróz töltetű 50 affinitásos oszlopon, majd sejtfal-elleni antitest tartalmú immunszorbens oszlopon vezettük át. Ez az oszlop az A, B és C antigéneket egyaránt megköti. Kioldásukat 0,05 mólos trisz HC1 puffer oldatban (pH = 7,5) oldott 3 mólos nátrium-tiocianáttal vé- 55 geztük, majd ez utóbbit dialízissel eltávolítottuk és az antigén proteinek oldatát ammónium-szulfátra 1 mólos 0,05 mólos trisz HC1 puffer oldattal (pH = 7,5) egyensúlyoztuk ki. Ezt a mintát kromatografáltuk Phenyl Sepharose CL-4B (Pharmacia 60 Fine Chemicals) töltetű oszlopon, majd az oszlopon megkötött fehérjét folyamatosan csökkenő koncentrációjú ammónium-szulfáttal és ezzel egyidőben folyamatosan növekvő koncentrációjú etilén-glikollal oldottuk ki (a végső koncentrációk es 40 45 0%, ill. 50%). A C antigént 0.6-0,7 mól ammónium-szulfát és 15-20% etilénglikol koncentrációk között oldottuk le, az A és B antigének előtt. Az így készült C antigént használtuk azután monospecifikus antiszérum előállításához. A C-specifikus immunszorbens oszlopok egy lépésben tették lehetővé az antigén tisztítását. Fogszuvasodás elleni védelem sejtfallal végzett immunizálással A Streptococcus mutans Ingbritt törzs fentiekben leirt módon készült sejtfalaival végzett két külön immunizációs kísérlet során megállapították, hogy az majmoknál (Macaca fascicularis) védelmet alakít ki szuvasodás ellen. E kísérleteket részletesebben Bowen és mtársai [British Dental Journal, 139,45-48 (1975)] és Cohen és munkatársai [British Dental Journal, 147, 9-14 (1979)] közölték. A Bowen és mtársai által leírt C kísérletben szuvasodást elősegítő étrenddel táplált öt kontroll állagot hasonlítottak össze sejtfallal immunizált négy állattal. Öt évvel a kísérletek megkezdése után a kontroll állatoknál a szuvasodásos megbetegedések száma 64 volt, míg az immunizált állatok esetében csak 4. Ez a védelem legalább 9 éven át tartott [Cohen és mtársai, (1979)]. A kísérleti állatokból 5 év után levett szérfimokat megvizsgálva megállapították, hogy az immunizáció során A, B és C antigén elleni antitestek egyaránt képződtek, viszont további antigének elleni antitesteket nem tudtak kimutatni. Az antitest-válaszok mennyiségi meghatározását az ELISA-módszerrel (enzyme-linked immunosorbent assay), majd a Voller és munkatársai féle mikrolemez módszerrel (Voller és mtársai, Flowline Publications) végeztük. Műanyag mikrotitrálótálcákat kb. 1 pg/ml koncentrációjú tiszta C antigénnel vontunk be. A majmok szervezetében képződött antigénhez kötött antitest mennyiséget úgy mértük, hogy lúgos foszfatázhoz (Sigma Chemical Co.) kötött antihumán IgG-vel inkubáltuk, majd meghatároztuk egy kromofor anyag (p-nitro-fenol) keletkezését olyan módon, hogy abszorpcióját mértük 405 nmen. Az 1. ábrán kontroll és immunizált majmok antiszérumának mérési eredményeit mutatjuk be. A számszerű értékeket az 1. táblázatban foglaljuk össze. Az eredmények azt mutatják, hogy a sejtfallal végzett immunizálás után a C antigén elleni antitest szintje jelentősen emelkedik. Meg kell azonban jegyeznünk, hogy a nem immunizált kontroll állatok esetében is képződik idővel bizonyos mennyiségű Streptococcus mutans antigén elleni antitest [Russel és Beighton, Infection and Immunity, 35, 741-744 (1981)].
