187734. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fogszuvasodás elleni antigén- készítmények és ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 187 734 2 C antigén 1. A sejtfalak előállítása Az előállításhoz az ismert Ingbritt törzshöz tartozó Streptococcus mutans-törzsef alkalmaztuk. 5 E törzset Krasse írta le [Árchs. Oral Bioi., 11, 429-^136 (1966)] és Coykendall szerint az I. genetikai csoporthoz, Prench és munkatársai szerint a c szerotípushoz tartozik. A törzs a National Collection of Industrial Bacteria (Aberdeen, Skócia) in- 10 tézménynél, NCIB 11 516 szám alatt van letétbe helyezve. Hasonló eredményt kaptunk egy az Ingbritt törzshöz igen hasonló másik baktérium törzs alkalmazásával, amely a National Collection of Type Cultures, (Colindale, London) intézménynél 15 NCTC 10 449 szám alatt van letétbe helyezve. A baktériumokat az Ellwood és mtársai [Archs. Oral. Bioi., 19,659-664 (1974)] által leírt táptalajon tenyésztettük, 600 ml-es kemosztátban 0,05/óra hí- 2Q gítási sebesség mellett, miközben a pH-t káliumhidroxid automatikus adagolásával 6,5-ös értéken tartottuk. A baktériumokat centrifugálással nyertük ki, sós vízben mostuk, 60 °C-on 30 percig melegítettük az autolitikus enzim hatástalanítása érdékében, majd No. 12 Ballotini típusú üvegágyon 25 (gyártó: Jencons Ltd., Hemel Hempstead, Herts, UK) Mickle Tissue dezintegrátorral (gyártó: Mickle Instruments Ltd., Gomsshalk, Surrey, UK) aprítottuk. .Az így aprított sejteket szűréssel elválasztottűk az üvegágytól, kétszer vízzel, majd kétszer 30 1 mól/1 -es NaCl-dal mostuk, végül Potter homogenizátor segítségével 10 g/1 koncentrációjú SDS vizes oldatában szuszpendáltuk. Az ép baktériumokat alacsony fordulatszámon végzett centrifugálással a sejtfalaktól elválasztottuk, majd a sejtfalakat 35 sós vízben, utána tiszta vízben mostuk, végül fagyasztva szárítottuk. Hasonló eredményt kaptunk a Todd-Hewitt táptalajon szakaszos módon tenyésztett baktériumokkal [J. Path and Bacteriol., 35, 973-974 40 (1932)], valamint glükózt, tripton és élesztő gomba extraktumot tartalmazó tápközegen [R.R.B. Russell, J. Gen. Microbiol., 114, (1979)109] ellenőrzött pH-n. A sejteket vagy Braun-féle homogenizátorral aprítottuk, vagy szobahőmérsékleten SDS-sel 45 hosszabb ideig extraháltuk. hez és tisztításához egyaránt. Ha az Ingbritt törzs tenyészetéből (vagy hasonló törzsekből) nyert proteineket használtuk antigénként a keresztezett immunelektroforézis kísérletben, amelyet Axelsen és munkatársai módszerével végeztünk (Axelsen et al.: „A Manual of Quantative Immunoelectrophoresis”, Oslo, 1973) és sejtfal elleni antiszérummal elektroforetizáltuk, három precipitátum-csúcsot figyeltünk meg. A kísérlet során a közbülső gél módszerrel (Axelsen és mtársai., 71. o.) A és B antigént vagy A-ra és B-re monospecifikus antiszérumot tartalmazó gélekkel kimutatható volt, hogy a két precipitátum csúcs az A és B antigéneknek felel meg, míg a harmadik csúcs egy másmilyen antigénnek, mégpedig a C antigénnek. Annak érdekében, hogy a C antigén természetét megismerjük, az antigén-készítményt a keresztezett immunelektroforézis vizsgálat előtt különböző egyéb vizsgálatoknak vetettük alá. így megállapították, hogy 200 (ig/ml koncentrációjú tripszin vagy pronáz fehérjebontó enzimmel 3 órán át 37 °C-on kezelve lebontható, tehát a C antigén fehérje-természetű. Egy másik vizsgálatnál a C antigént 5,0 pH-jú puffer oldattal 3 órán át kezeltük; megállapítottuk, hogy szétroncsolható, tehát savérzékeny. A C antigén fizikai tulajdonságai közül molekulasúlyát és izoelektromos pontját határoztuk meg. A meghatározásokat a keresztezett immunelektroforézis módszerével - ahol az SDS poliakrilamidgélen az első dimenzió szerinti szétválasztás a fehérjék molekulasúlya alapján történik [Russel, J. Gén, Microbiol., 114., 109-115 (1979)]-vagy a keresztezett immunfókuszálás módszerével agarózon végeztük [Rosen és Aman, J. Immunoi. Meth., 28, 1 (1979)], ahol a szétválasztás alapja a fehérjék töltése. A vizsgálatokkal a C antigén molekulasúlyára 70 000 ±5000 értéket, izoelektromos pontjára pedig 4,45±0,24-et határoztunk meg. A C antigén az immundiffúzió módszerével a sejtfal vagy a tiszta C antigén elleni antiszérummal is kimutatható. Ezért az immundiffúziót használtuk arra, hogy kimutassuk: 6 másik c-szerotípusú Streptococcus mutans törzs, valamint az e és f szerotípusú törzsek is termelnek C antigént. 2. Antiszérum készítése 50 A fagyasztva szárított sejtfalakat steril, 1 mg/ml koncentrációjú vizes sóoldatban szuszpendáltuk, majd az így kapott szuszpenziót alkalmaztuk majmok vagy nyulak immunizálására. A nyulak 3 hét időközönként összesen 3 intramuszkuláris injekciót kaptak, ezek mindegyike 1 ml sejtfalat tartalmazott 10% alumínium-hidroxid tartalmú sóoldatban. Az utolsó injekció után 1 héttel az állatok vérét szivén keresztül megcsapolva nyertük az antiszérumot. 3. Immunelektroforézis kísérletek Az előzőekben leírt módon készült sejtfal elleni antiszérumot alkalmaztuk a C antigén jellemzésé- « 4. A C antigén tisztítása Mint az előzőekben már rámutattunk, a C antigén egyaránt jelen van a sejtfalon és a sejtmentes tenyészetszűrletben. Bár a megfelelő módszert alkalmazva a C antigén a sejtfalból is kivonható, előnyösebb, ha e műveletet a tenyészet szűrletéből végezzük, mivel a szürlet kevesebb olyan anyagot tartalmaz, amelyek a tisztítás során nehézséget okozhatnak. Bár a C antigén tisztítását a szokásos oszlopkromatográfiás módszerekkel - például alkalmas géladszorbens vagy ioncserélő töltet alkalmazásával - is végezhetjük, e művelet elvégzéséhez legmegfelelőbb az immunszorbens affínitásos kromatográfia módszere, amelyre az alábbi példákat adjuk: 4
