187734. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fogszuvasodás elleni antigén- készítmények és ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 187 734 2 d) fehérjebontó enzimekkel lebonthatók, e) izoelektromos pontjuk: 4,45 ± 0,24, és /) szív-szövettel nem lépnek keresztreakcióba. A találmány szerinti antigén készítmény egyetlen antigén-fehérjeként tartalmazhat C antigént, de egy másik kiviteli alak esetén a készítmény a C antigén mellett más, szív-szövettel keresztreakcióba nem lépő antigént is tartalmazhat. Erre alkalmas a 2 033 233 A számú angol szabadalmi bejelentésben ismertetett A antigén. ' " A találmány szerinti antigén készítményeket például vakcinák formájában lehet alkalmazni. Ezek tartalmazhatják a gyógyszerkészítményeknél szokásos hígítószereket, vivő- és segédanyagokat (pél- 15 dául alumínium-hidroxid), stabilizálószereket és bakteriosztatikumokat. A vakcinák alkalmasak lehetnek szubkután, intramuszkuláris, intravénás vagy szubmukóz adagolásra. Jellemző adagjuk 1—50 pg, előnyösen 10 pg antigén testsúlykilo- 2Q grammként. Az immunizálást végezhetjük orális kezeléssel is, például az antigént tartalmazó készítmény beadásával, vagy a C antigént tartalmazó szájöblítőszer vagy fogpaszta ismételt alkalmazásával. . , 25 A találmány szerinti eljárással előállitott antigén készítmények fogszuvasodást gátló hatása a test immunreakciója során az adott antigénre képződő antitesteknek köszönhető. Ilyen antitestek képződhetnek ezenkívül olyan ismert eljárással is, amikor egy alkalmas Streptococcus mutánsból előállított d antigén készítményt például tehenekbe vagy nyulakba fecskendezünk, majd a vérüket kifolyatjuk. Az ily módon készült antitesteket a gyógyászatban alkalmazott hígító- vagy hordozóanyagokkal gyógyszerkészítményekké alakítva szintén alkalmazhatjuk fogszuvasodás megelőzésére vagy csökkentésére. A találmány oltalmi köre kiterjed olyan antitest készítmények előállítására is, amelyek specifikusak a C antigén antigén hatású determinánsaira vagy amelyek a C antigén elleni antitesteket 4 tartalmaznak, továbbá vonatkozik olyan gyógyszerkészítményekre, amelyek a fentiekben leírt antigén készítményeket és a szokásos hígító- és hordozóanyagokat tartalmazzák, valamint olyan készítményekre, amelyek a C antigén elleni antiteste- 45 két tartalmazzák hígító és hordozóanyagokkal együtt. A C antigén jelen van a Streptococcus mutans sejtfalán és a sejtmentes tenyészet szürletében egyaránt. így a Streptococcus mutans sejtfalából a 50 proteinek eltávolítására szokásos eljárásokkal kivonható, de előnyösebb, ha vagy a tenyészet sejtmentes szürletéből vagy a teljes Streptococcus mutans sejtből végezzük a kivonást, mivel az így nyert anyag kevesebb olyan anyagot tartalmaz, amely a 55 tisztítás alatt nehézséget okoz. A találmány vonatkozik még az olyan C antigén tartalmú készítmények előállítási eljárására is, amelyek fogszuvasodást csökkentének vagy megelőznek, és amelyek Streptococcus mutans törzsből 60 származó, szív-szövettel keresztreakcióba lévő antigéneket nem tartalmaznak, növekvő Streptococcus mutans törzsből lettek kitenyésztve úgy, hogy a tenyészetből legalább a sejtfalakat eltávolították, és a visszamaradó fehérje oldatból elkülönítették a kívánt antigén készítményt. Az elkülönítés történhet oszlopkromatográfiával a megfelelő gélek, ioncserélők vagy hidrofób kölcsönhatásba lépő anyagok alkalmazásával, de előnyösebb a C antigén elleni rögzített antitesteken végzett affinitásos kromatográfia. A rögzített antitestek lehetnek C antigénre monospecifikus antitestek vagy a C antigén ellen sejthibridizációs módszerrel előállított egy vagy több monoklón tulajdonságú antitestek. Ha a C és A antigének keverékére van szükség, a két antigént vagy külön-külön készítjük rögzített antitesteken végzett affinitásos kromatográfiával, és utólag keverjük össze őket, vagy egy lépésben közvetlenül a keveréküket állítjuk elő a C és A antigének elleni rögzített antitestek kombinációján végzett affinitásos kromatográfiával. A tápközeg a Streptococcus mutans bármely szokásos tápközege lehet, így például a Todd-Hewitt táptalaj [E. W. Todd és mtársai.: J. Path Bacteriol. 35 (1932) 973], tripton/élesztőgomba kivonat [R.R.B. Russell, J. Gen. Microbiol., 114 (1979) 109], vagy kémiailag meghatározott tápközeg. A szükséges tisztítás megkönnyítése érdekében ez utóbbi különösen előnyös. A G antigén a tenyésztés bármelyik szakaszában kivonható. A sejtek szaporíthatok szakaszos tenyésztéssel, kinyerésüket a korai stacioner fázisban végezve, de alkalmazható folyamatos tenyésztés is 0,01-0,1 előnyösen 0,05 óra hígítási sebességgel. A fehérje oldat lehet maga a tenyészet-szűrlei, amelyet a teljes sejtek eltávolításával nyertünk, vagy lehet sejtkivonat, amelyből a sejtfalakat és egyéb törmelékeket eltávolítottuk, továbbá lehet ezek keveréke is, amelyet úgy nyerünk, hogy az. egész tenyészet sejtjeit összetörjük és a sejtfalakat és törmelékeket eltávolítjuk. A sejtfalak eltávolítása akár egész sejtek, akár törmelék esetében a szétválasztás után a szokásos módszerekkel, így centrifugálással vagy szűréssel történhet. A találmány szerinti készítményt és eljárást az alábbi példák és a hozzátartozó rajzok segítségével részletesebben is bemutatjuk. Az 1. ábrán a négy kontroll majmon és négy sejtfallal immunizált majmon IgG szérummal az ELISA-módszerrel (enzymlinked-immunsorbent assay) meghatározott C antigén elleni antitest mennyiséget adjuk meg [Bowen és mtársai (1975) C kísérletében leírtak szerint] a p-nitrofenol 405 nm-en mutatott abszorpcióját a szérum-hígításának függvényében ábrázolva. A 2. ábrán összehasonlítjuk Streptococcus mutans sejtfallal immunizált három majom (Macaca fascicularis) és öt kontroll majom állandó fogazatán kialakult szuvasodást [Cohen et al. (1979) 19. kísérletében leírtak szerint], és a 3. ábrán négy kontroll majom és sejtfallal immunizált négy majom szérumából az ELISA- módszer szerint IgG szérummal meghatározott C antigén elleni antitest mennyiséget adjuk meg [Cohen et al. (1979), 19. kísérletben leírtak szerint], a p-nitrofenol 405 nm-en mutatott abszorpcióját a szérum hígításának függvényében ábrázolva. 3
