187734. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fogszuvasodás elleni antigén- készítmények és ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására

. 187 734

2

A találmány Streptococcus mutans baktériumfajból előállítható, antigén-hatású fehérjekészítmények előállítására vonatkozik, amelyek vakcinákban alkalmazhatók fogszuvasodás megakadályozására. A találmány tárgya továbbá eljárás ilyen készítményeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására.

Ismeretes, hogy a Streptococcus mutans baktériumoknak jelentős szerepük van a fogszuvasodás kiváltásában. Számos laboratóriumban viszont kimutatták, hogy a kísérleti állatokon csökkenteni lehet a szuvasodás mértékét az ilyen baktériumból készült vakcinával végzett aktív immunizációval. Kísérleti úton kimutatták, hogy például Macaca fascicularis majmok esetében akár intakt Streptococcus mutánssal, akár sejtfalban gazdag ilyen anyaggal végzett immunizálás után a répacukorban gazdag étrend ellenére jelentős fogszuvasodás csökkenés következett be [Bowen és mtársai, British Dental Journal, 126, 159-160 (1969); Bowen és mtársai, British Dental Journal, 139, 45-50 (1975); Cohen és mtársai, British Dental Journal, 147,9-14

(1979) ]. Kimutatták továbbá azt is, hogy ez a védőhatás netji alakul ki abban az esetben, ha tripszinnel lebontott fehérjéjű Streptococcus mutans sejtfalait alkalmazták, ami azt jelzi, hogy a Streptococcus mutans sejtfala feltehetően tartalmaz egy olyan fehérjekomponenst, amely a védő-immunizáló hatás szempontjából fontos [Colman és Cohen, Pathegenic Streptococci, 214 (1979), M.T. Parher, Reedbooks, Chertsey, Nagy-Britannia].

Minden immunizációs folyamatban fontos felismerni azt a baktérium-komponenst, amelynek a védőhatás kialakulása szempontjából szerepe van. Ennek egyik kézenfekvő oka, hogy a készítményekről felhasználás előtt így megvizsgálható, tartalmazzák-e a védőhatás szempontjából szükséges komponenst. Emellett a védőhatású antigén tisztításával olyan vakcinák előállítására is lehetőség van, amelyek már nem tartalmazzák a nem kivánt, vagy mérgező alkotókat.

Streptococcus mutans esetében kimutatták, hogy tartalmaz egy olyan komponenst, amely antigén keresztreakcióba lép emlősök szív-szövetével [pl. Hughes és mtársai, Infect Immun, 27, 576-588

(1980) ]. Ennek ismerete azért fontos, mert így ezeket ki tudják hagyni a vakcina-készítményekből.

M. W. Russell és mtársai. [Infection and Immunity, 28, (1980) 486 és Immunology, 40, (1980), 97] és a 2 060 647 A számú angol szabadalmi leírás négy (I,I/II, II és III jelű) a Streptococcus mutans törzs sejtfalából elkülöníthető antigént ismertet, melyek fizikai tulajdonságai a következők:

Molekulasúly

Izoelektromos pont

I

146,000-155,000

5,0-5,2

I/II

175,000-195,000

4,7-4,9

II

47,000- 49,000

4,0-4,1

Hl

39 000-Az antigének izolálását anioncserélő kromatográfiával, gélszűréssel vagy immunoszorbens kromatográfiával végezték. A fenti antigének közül csak

a nagyobb molekulasúlyú (I és I/II) antigének használhatók fogszuvasodás elleni vakcinákban.

W. E. Nesbitt és mtársai. [Infection and Immunity, 28, (1980) 118] 79 000 molekulasúlyú Streptococcus mutans sejtfal fehérjét ismertet. Ez az anyag stabilitásával és a sejtfalhoz való erős kötődéssel jellemezhető, mivel onnan 3%-os nátrium-dodecilszulfát oldattal való 90 perces 100°C-on történő kezeléssel távolítható csak el.

A 2 033 223 A számú angol szabadalmi bejelentés két, a Streptococcus mutans sejtfalából izolálható antigén tulajdonságú fehérjét ismertet. Az egyiket (jele A antigén) a fenti szabadalmi bejelentésben igénylik, a másiknak (jele B antigén) viszont kimutatható keresztreakció-képessége van szívszövettel, így humán célra szánt vakcinákban nem alkalmazható. Az A és B antigének a következőkkel jellemezhetők:

a) jelen vannak az I. genetikai csoporthoz tartozó Streptococcus mutans törzsek sejtfalán [Coykendall, J. Gen. Microbiol. 83, 327 (1974)]. Ez a genetikai csoport tartalmazza a Perch et al- által definiált c, e, f, szerotípusú törzseket [Actà Path Microbiol. Scand., B 82, 357 (1974)];

b) lOg/l-es dodecil-szulfát (SDS) oldattal 20 percig végzett főzés után nem távolíthatók el a sejtfalról;

c) SDS-poliakril-amid gél elektroforézissal (SDS-PAGE) meghatározott látszólagos molekulasúlyuk A antigén esetében: 29 000 körüli, B antigén esetében: 190 000 körüli;

d) akril-amid gélben izoelektromos fókuszálással meghatározott izoelektromos pont az A antigén esetében: 4,3 körüli, a B antigén esetében: 5,4 körüli, és az A antigén esetében az antigén proteinek

e) fehérjebontó enzimekkel lebonthatók, és

/) szív-szövettel nem lépnek keresztreakcióba.

Felismertük, hogy az I. genetikai csoportba tartozó Streptococcus mutans törzsek sejtfalából egy további antigén-hatású fehérje csoport (C antigén) is izolálható. A fehérjéknek ezt a csoportját monospecifikus antiszérumok előállítására lehet felhasználni, és a Streptococcus mutans sejtfalat tartalmazó vakcinákban szerepük van a fogszuvasodással szembeni védőhatás kialakulásában. Előnyük még, hogy emlősök szív-szövetével nem lépnek reakcióba.

A fentiek alapján a találmány tárgya eljárás egy C antigén tartalmú készítmény előállítására, amely nem tartalmaz Streptococcus muntansból származó szív-keresztreakcióra képes antigéneket, és alkalmazható fogszuvasodás ellen.

A C antigén az antigén-tulajdonságú fehéijék azon csoportjába tartozik, amelyre jellemző:

a) jelen vannak az I. genetikai csoporthoz tartozó Streptococcus mutans, azaz a c, e, f szerotípusú törzsek sejtfalán,

b) 10 g/1 koncentrációjú vizes nátrium-dodecilszulfát (SDS) oldattal 10 perc főzés után a sejtfalról eltávolíthatók, de ugyanezzel az oldattal 15’C-on kezelve távolíthatók el,

c) poliakril-amid gél elektroforézissal (SDSPAGE) meghatározott molekulasúlyuk 70 000 ±5000,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

2