187709. lajstromszámú szabadalom • Eljárás maláriaellenes antigén preparátum és vakcina előállítására
1 .187 709 2 molekulasúlya az eredeti antigéntől függ, de azt találtuk, hogy a nagyobb töredékek molekulasúlyai 0,3-0,4 x [0s; 0,7-0,8 x I05 illetve 1,0-1,4* 10*, tehát jóval kisebbek, mint az eredeti antigéné. A Plasmodium falciparum szinkron kultúráiban ez a lebomlás nem a fehérje szintézissel egy időben megy végbe, hanem úgy tűnik, hogy az erythrocytán belüli fejlődési ciklus végén a merozoit érésével illetve felhasználásával esik egybe. Valószínű, hogy inkább diszkrét töredék(ek) semmint maga az antigén vannak a merozoitok felületén. A szakmában jártasak értékelni tudják azt, hogy a fent definiált antigének védettséget kiváltó előnyös tulajdonságai nemcsak magának az eredeti antigénnek vannak meg, hanem töredékeinek is, azoknak is, melyek az erythrocytán belül képződnek, és azoknak az anyagoknak is, melyek az eredeti antigént vagy annak töredékeit tartalmazzák. Az összes ilyen anyagot „funkcionális származékoknak” nevezzük. Az antigén fehérjék bármely eljárással készíthetők, melyek az ilyen antigének előállítására a szakmában ismeretesek. Az összes ilyen módszer szerint vagy a parazitából izoláljuk az antigén fehérjét, vagy kémiailag illetve biológiailag reprodukáljuk az antigén fehérjét. Az egyik ilyen módszer szerint a parazita schizonta formájából izolálhatjuk az antigén fehérjét, a találmány szerinti antigénre specifikus monoklón antitestek segítségével. A monoklon antitestek segítségével történő antigén szétválasztási módszert ezideig még nem alkalmazták a malária antigének tisztítására. A találmány szerint tehát az antigén fehérjét a következőképpen állítjuk elő: 1. Szolubilizáljuk a plasmodium paraziták schizonta formáját tartalmazó erythrocytákat; 2. A szolubilizált anyagot érintkezésbe hozzuk a kívánt antigén fehérjére specifikus monoklón antitestekkel, és így egy antitest-antigén komplexet alakítunk ki; és 3. Az antitest-antigén komplexből kivonjuk az antigén fehérjét. A schizonta a szakmában ismert bármely módszer szerint szolubilizálható. A parazita anyag szolubilizálásánál olyan feltételeket alkalmazunk, amelynél nincs számottevő fehérje bomlás vagy denaturáció. Főként ezek úgy szolubilizálhatók, hogy detergenssel hozzuk érintkezésbe, amely lehet akár ionos vagy nem-ionos típusú, bár a nem-ionos detergensek használata célszerűbb. Ilyen detergens például a Nonidel P40, a Triton X-100, a Brif 99 (ezek bejegyzett védjegyek, gyártja a Shell, Rohm and Haas illetve az ICI), továbbá a polioxietilén(12)-tridecil-éter, mely Renex 30 néven ismert detergens (gyártja a Honeywell Atlas Ltd). A detergenst 0,01-5 térfogat % végső koncentrációban alkalmazzuk. A találmány szerinti eljárásnál alkalmazott monoklón antitesteket a szakmában ismert bármely módszerrel előállíthatjuk (pl. Milstein, Scientific American 1980. 243, 4, 56-64). Eszerint a módszer szerint az illető parazitával szemben immunizáltak egy egeret, ez esetben például egy rágcsáló malária parazitával történő fertőzéssel. (A lymphociták mindegyikének megvan az a független képessége. hogy antitestet képezzen, amely felismeri a különböző antigén determinánsokat, ezt azután izoláljuk és összekeverjük egér-myeloma sejtekkel és így „hibridomát” alakítunk ki.) Minden hidridoma képes a saját szülő lymphocita antitestét termelni és klónozható. Az egyedi hibridomák kiválasztása (s/.krinelése) egy vagy több olyan sejt vonalat hoz létre, amely antitestet termel, egy olyan monoklón antitestet, amely az érdekelt antigén determinánsra specifikus és a sejt-vonalat ezután nagymennyiségű monoklón antitest előállítására használjuk, amely azután használható az érdekelt antigén determináns elválasztására és tisztítására. Az itt definiált antigénekre specifikus antitesteket könnyen azonosíthatjuk egyszerű, jól ismert vizsgálati eljárások segítségével. A monoklón antitest könnyen felvihető valamely közömbös hordozóra, például Sepharose-ra (védjegy) és a szolubilizált anyag áthajtható az antitestet tartalmazó hordozón. Ezt célszerűen egy oszlop segítségével végezzük. Az antigén fehérje az antitest-antigén komplexből a komplex széthasításával szabadítható fel. Ennek feltételei jól ismertek a szakmában jártasak előtt. Alkalmas módszer, amelynél a szóbanforgó fehérje megőrzi immunogenitását a dietilaminnal történő mosás, magas pH mellett, például 11,5-es pH-nál, alkalmas detergens jelenlétében. A fent leírt antigének vakcinává alakíthatók, mellek a maláriával szemben érzékeny, a Plasmodium nemzetségébe tartozó paraziták fertőzésének kitett gerinces parazitagazdát imunissá teszik. E célra az antigén fehérjéket gyógyászatilag elfogadható hordozókkal keverjük össze. Az antigén fehérjéket használhatjuk egyedül vagy annak más funkcionális származékaival együtt, vagy más olyan fehérjékkel, amelyek védelmet biztosítanak maláriával szemben. A találmány tárgyát képezi továbbá az olyan oltóanyagok előállítása, melyek maláriával szemben védettséget biztosítanak, és amelyek hatóanyagként a fent leírt antigént illetve annak valamely funkcionális származékát tartalmazzák, a gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagokkal elkeverve. Ebből a szempontból gyógyászatilag elfogadható hordozók az olyan folyadékok, melyek alkalmasak arra, hogy az antigént a paciensbe juttassuk. Ilyen hordozó például a konyhasó oldat. Az antigén protein oldott vagy szuszpendált állapotban lehet jelen a hordozóban, vagy szolubilizálhatjuk valamely gyógyászatilag elfogadható detergens hozzáadásával. A vakcina tartalmazhat valamely adjuvánst, amely növeli az immun választ és ezáltal erősíti a vakcina hatását. A találmány szerinti vakcina eseteben jól használható adjuváns például a Freundfele komplett adjuváns, vagy méginkább a szaponin, Corynebacterium parvum (coparvax) és az alumínium-hidroxid vagy ezek elegye, illetve egyéb adjuvánsok. Az oldóanyagot célszerűen úgy készítjük, hogy az 0,2-5 mg/liter végső koncentrációban tartalmazza az antigén fehérjét, de legcélszerűbb, ha 1 mg/liter mennyiségben. Az elkészítés után az oltó5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
