187709. lajstromszámú szabadalom • Eljárás maláriaellenes antigén preparátum és vakcina előállítására
1 187 709 2 anyagot steril tartóba juttatjuk, melyet aztán lezárjuk és alacsony hőmérsékleten tárolunk, például 4°C-on, vagy liofilizálunk. A gerinceseket az alkalmas módon formulázott oltóanyagnak egy vagy több dózisával tehetjük imunissá a maláriával szemben. Egy dózis 0,1-2 ml, célszerűen 0,2-1 ml, de leginkább 0,5 ml oltóanyagot tartalmaz. A vakcina bármilyen szokásos módon adagolható, beleértve az orális, és paranterális (pl. szubkután vagy intramuszkuláris) injekció útján történő adagolást. A kezelés állhat egyetlen dózisból, vagy több dózisból egy bizonyos idő alatt. Az alábbi példák a találmány szerinti eljárást illusztrálják anélkül azonban, hogy korlátoznák annak oltalmi körét. 1. példa Hybridoma vonal származtatása Plasmodium yoelii antigénhez Plasmodium yoelii-ra immunis két BALB/c egérből származó lépsejteket P3-NSl/l-Ag+ — 1 myeloma sejtekkel fuzionálunk, polietilén-glikol jelenlétében (Galfare és munkatársai féle általános módszer: Natura, 1977 . 266.) A sejteket 144 szövet kultúrára osztottuk szét 2 ml térfogatú HAT- szelektív közegbe (Littlefield, Science, 1964. 145. 709-710), melynek alapját 10% magzati borjú szérummal kiegészített RPMI 1640 (beszerezhető: Flow Lab., Woodcock Hill, Harefield road) alkotja. 10 nap múlva a kultúra felülúszó rétegét megvizsgáltuk Plasmodium yoelii-specifikus antitestekre, indirekt immunfluoreszcencia módszerrel (HF). A 143 megvizsgált kultúrából 38 volt pozitív. Az 1-es számú kultúra olyan antitesteket tartalmazott, amely a schizontákban előforduló, de a gyűrű képző adtrophozoitokból hiányzó antigénre volt specifikus. Ebből a kultúrából klónozott hybridoma sejt vonalat készítettünk úgy, hogy az egyes sejtekből médiummal felülrétegzett félig szilárd agaron kolóniákat növesztettünk. A klónozott hybridoma vonalat, melyet egyetlen antitestjének termelése céljából tartottunk fenn, W1C 25.1-nek jelöltük, és a Pasteur Intézetben 1—160 szám alatt helyeztük el 1981. július 16-án. A hybridoma vonalat BALB/c egerekben mint ascites tumort tovább tenyésztettük, és ezekből az egerekből vett ascites folyadék és szérum kb. 10 ng/ml-nyi monospecifikus antitestet tartalmazott. Egy másik hybridoma vonal, a W1C 45.1, ugyanazon antigénekre specifikus antitestet választott ki, mint amire a 25.1 antitest, azzal a különbséggel, hogy ez valószínűleg csak a 0,9 x 105- nél nagyobb molekulasúlyú antigént és töredékeket ismeri fel. 2. példa Antigén előállítása Plasmodium yoelii-böl A Plasmodium yoelii vér-formáit CD-I egerekben 80-90% parasitaemiáig növesztettük és az erythrocytákat összegyűjtöttük és szolubilizáltuk. A sejteket a fehérjebontó hatás elkerülése céljából 4 °C-on, lizis segítségével szolubilizáltuk, 1 mmól fenil-metil-szulfonil-fluoridot (PMSF), 0,1 mmól tozil-L-lizin-klórmetil-ketont (TLCK), 5 mmól etilénglikol-bisz-(amino-etiléter)-N, N’-tetraacetátot (EGTA) és 5 mmól jód-acetamidot tartalmazó, 50 mmól Tris, 5 mmól etiléndiamin-tetraecetsav (EDTA), 1% Nonidet P40 pH 8-as pufferben. A felbontott sejteket 100 000 g-vel centrifugáltuk és a felülúszó részt, amely az erythrocyták oldható fehérjeit és néhány membrán fehérjét tartalmazza a parazitafehérjék közel 70%-ával együtt, összegyűjtöttük. (Ez utóbbi mennyiséget az in vitro inkorporáció után mért 35S-metionin tartalmából számítottuk ki.) Az egereknek a W1C 25.1 hybridoma vonalat tartalmazó ascites-folyadékából nyert immunglobulint Protein-A-Sepharose-hoz kötve és 3-as pH- nál egyszer eluálva, megtisztítottuk. Az immunglobulin frakciót brómciánnal aktivált Sepharose-hoz kapcsoltuk, 10 ml immunglobulint használva 1 ml duzzadt gélhez. Az immun-abszorbenst alaposan kimossuk, oszlopokba helyezzük és 10 mmól Tris, 1 mmól EDTA, 1 mmól EGTA és 1% NP 40 pH 8-as oldattal egyensúlyba hozzuk. A fent leírtak szerint kapott felülúszó réteget átengedjük egy immunabszorbensen, mely 10 mmól Tris, 1 mmól EDTA, 1 mmól EGTA, 1 %-os NP 40 tartalmú pH 8-as oldattal van egyensúlyba hozva, és ugyanezzel a pufferral átmosva. A nem specifikusan kötött anyagot 5 oszloptérfogatnyi olyan fenti pufferrel távolítjuk el, mely 0,5 mól nátriumkloridot is tartalmaz. Az oszlopot ezután olyan 8-as pH-jú pufferrel mossuk, mely 10 mmól Trist, 1 mmól EDTA-t, 1 mmól EGTA-t és 0,1% NP 40-et tartalmaz. A specifikus eluálást 50 mmól dietilamin és 0,1 % NP40 11,5-ös pH-jú oldatával végezzük. Az eluált anyagot mégegyszer kromatografáljuk immunabszorbens anyagon. A specifikus aluátumot 10 mmól Tris, 1 mmól EDTA, 1 mmól EGTA és 0,1 % NP 40 tartalmú, 8-as pH-jú pufferrel szemben dializáljuk. A mintát újra felöntjük egy oszlopra, melyet ezzel a pufferrel újra egyensúlyba hoztunk, és 10 mmól Tris, 1 mmól EDTA, 1 mmól EGTA, 0,5% nátrium-deoxikolát tartalmú 8,2-es pH-jú pufferrel átmossuk. A visszamaradt anyagot 50 mmól dietilamin és 0,5% nátrium-deoxikolát 11,5-es pH-jú oldatával eluáljuk. Az eluátumot betöményítve és dializálva megkaptuk az antigént. 3. példa A Plasmodium yoelii-böl előállított antigén és fehérjebontással készített töredékeinek biokémiai jellemzése. Az antigént a fehérjébe inkorporált 3SS-metioninnal megjelöltük úgy, hogy a parazitával fertőzött sejteket 2-3 óráig inkubáltuk egy olyan közegben, amely nagy fajlagos aktivitású ilyen aminosavat tartalmazott. A megjelölt antigén fehérjét immunprecipitációval állítottuk elő úgy, hogy az immun komplexet 25.1 monoklón antitesttel és „A” jelű fehérjét tartalmazó Staphylococcus aureus sejtekkel kicsaptuk. Ezt az anyagot SDS gél (nátrium-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
